第五章 酵母基因工程.pptVIP

（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 （二）酵母菌的宿主系统 （三） 酵母菌的载体系统 人工构建酵母质粒的共同特点： （四）酵母菌的转化系统 （五）酵母菌的表达系统 1、酿酒酵母表达系统 2、甲醇酵母表达系统 1）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 2）甲醇酵母表达系统的优缺点 3）甲醇酵母表达系统操作原理 宿主菌株与标记基因 Mut表型与甲醇利用率 甲醇酵母系统的整合事件 毕赤酵母系统 模式表达载体 ① AOX1位点插入 ② HIS4位点插入 ③ 多基因插入事件（串联整合） ④ 基因取代（GS115，AOX1+） 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 （六）利用重组酵母生产乙肝疫苗 Mut AOX1基因 AOX2基因 表型 Mut+ 存在 存在 正常型 Muts 缺失 存在 缓慢型 YRp型载体： 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合。 YIp型载体： 在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组； 有两种整合模式：插入、取代； 5’AOX1：含AOX1启动子，在甲醇诱导下启动外源基因表达； MCS：外源基因的插入位点； Sig：信号肽序列，使外源蛋白分泌到上清中，便于纯化； TT：提供转录终止和polyA信号； HIS4：营养缺陷型筛选标志，能与 酵母染色体HIS4基因同源重组； 3’AOX1：能与酵母染色体AOX1基因同源重组； Amp：在E.coli中的筛选标志； f1 ori：丝状噬菌体的复制起点。 载体的3’AOX1区与酵母基因组AOX1基因的末端发生整合重组。 载体的HIS4区与酵母基因组HIS4基因的末端发生整合重组。 表达载体类型 需带入ATG 单位点 胞内表达与分泌表达载体 表达载体类型 需带入ATG 多位点 信号肽：PHO1 信号肽：MF-? 目前，20余种重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中成功表达，如：人血清白蛋白(HSA)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)等。 数种重组蛋白在多形汉逊酵母表达系统中成功表达，如HBsAg。 乙肝病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由乙肝病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重传染病，每年约200万病人死亡，3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化、肝癌。 利用酵母大规模生产乙肝疫苗为其应用提供了保证。 目前对HBV还没有一种特效的治疗药物，乙肝疫苗可有效预防病毒感染。 HBV的结构与性质 HBV是蛋白包裹型的双链DNA病毒，有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径42nm，基因组3.2kb。 HBV的结构： 原生质体转化法的缺点： 转化率受原生质体再生率的严重制约。 操作周期长； 2）碱金属离子介导转化法 酵母菌完整细胞经碱金属离子(如Li+)、PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。 共转化现象极为罕见； 特点： 3）电击转化法 适用范围广。 酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下吸收质粒DNA。 特性： 转化率高； 操作方便； 用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因 显性基因 宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：leu-、trp-、his-、ura- 营养缺陷型互补基因 载体：携带相应的合成基因 如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3 选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基 显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。 显性标记基因 氨基糖苷转移酶 抗G418 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 铜离子螯合物 耐受铜离子 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂 标记基因 编码产物 遗传表型 aph cat dhfr cup1 su