嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌适体的SELEX筛选.pdfVIP

嗜水气单胞菌及迟缓爱德华茵适体的SELEX筛选 摘 要 嗜水气单胞茵和迟缓爱德华茵是水产养殖中比较常见的两种致病病原菌，易引起多种 水产养殖动物致病或致死，对水产养殖业造成了重大经济损失，同时对人也有一定的危害。 Evolutionof Enrichment， 指数富集系统进化技术(Systematic LigandsbyExponential SELEX)是一种结合分离、筛选、PCR的组合技术，其模拟达尔文进化过程可筛选到与靶 目标结合的适配子。本研究的目的就是利用SELEX技术建立一种快速检测嗜水气单胞菌 和迟缓爱德华菌的技术，为两种菌的检测提供了一种新的检测方法。 本研究利用体外人工合成一段长为78nt，中间随机序列为35nt，两端为固定序列的寡 核苷酸文库，利用已设计出的引物，以嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌为靶目标，利用SELEX 法筛选出能分别与嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌特异性结合的适体，并用磁珠富集及地高 辛．抗地高辛碱性磷酸酶显色系统(ELISA)，对筛选到的适体进行亲和力测定，最后一轮 的筛选产物克隆测序后分别对其一级结构及二级结构进行了研究。 1、经过12轮筛选，嗜水气单胞菌的亲和力吸光值由第一轮的0．32升到第9轮的0．72， 期长度是否一致分为两个群体，与预期长度一致的有33条，与预期长度不一致的只有6 条，分析发现保守序列GGTGG存在于所有的39条序列中。对其二级机构分析发现茎环 结构存在于所有的二级结构中，这可能是适配子与配体结合的构象结构。对嗜水气单胞菌 的39条适配子的二级结构进行分析，按照茎环出现位置的不同可分为7类。在利用39条 适配子分别测亲和力的基础上检测出嗜水气单胞菌的最佳适配子，并对嗜水气单胞茵的最 佳适体进行了特异性检测，其与嗜水气单胞菌的结合率为O．763，远高于与其他几种菌的 结合率，证明了筛选到的适体对嗜水气单胞菌有比较强的特异性。 2、经过14轮的筛选后，迟缓爱德华菌的亲和力吸光值由第一轮的0．632上升到第十 GGAGGX三条保守序列组成。对迟缓爱德华菌的适配子二级结构按照茎环出现的位置分 类可分为5类，通过比较分析其二级结构，发现二级结构原件中环是结合位点，而茎则是 稳定结构，二级结构都是以茎环状结构为主，推测茎环结构可能是适配子的结合关键，在 二级结构中同样存在着一些口袋结构，这可能是适配子的结合部位。 3、针对筛选过程中的纯化步骤做了一个对比发现，选择性纯化筛选到的适配子相比 每轮都纯化得到的适配子，其一级序列的同源性更高，同源性100％的序列出现的频率较 高。通过二级结构分析发现，每轮纯化筛选到的适配子二级结构按照茎环出现的位置只有 5类，而选择性纯化的适配子则有7类，这说明过多的纯化会导致适配子筛选丰富性大大 T 降低，对筛选起着弱化作用。 4、筛选到了针对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌的特异性适配子，并对嗜水气单胞菌 的适配子做了特异性验证，发现其与嗜水气单胞菌有了一定的特异性。 关键词嗜水气单胞菌，迟缓爱德华菌，适配体，SELEX，亲和力 II Theselectionof Aeromonas against aptamers withSELEX andEdwardsieIlatarda Abstract tardaarethetwocommon in Aeromonas andEdwardsiella pathogens hydrophila cause animalstobesickor economic a