牛卵母细胞冷冻前后CD9表达量对精卵结合影响.pdf

摘 要 CD9 是一种膜蛋白，参与细胞黏附、迁移 、增殖和分化等过程。哺乳动物 受精过程中，精卵结合和融合是重要环节，CD9 在此过程中发挥重要作用。随着 体外受精-胚胎移植和冷冻技术的发展，冷冻技术在动物种质资源的保存上得以 推广应用。虽然卵母细胞的冷冻方法在不断发展，但是由于冷冻后受到一定的损 伤，对其后期发育产生一定的影响。可是，冷冻卵母细胞在体外胚胎生产技术的 研究中显得尤为凸显。卵母细胞的冷冻保存要比胚胎冷冻保存应用前景更为广 泛，可以利用冷冻技术建立卵子库，这样不仅可以解决目前卵母细胞短缺问题， 还可以使其他生物技术不受时间和空间的限制。本研究探讨了不同发育期卵母细 胞冷冻前后CD9 表达量变化对精卵结合融合的影响。研究分为3 个实验，获得如 下结果： 1.冷冻对牛卵母细胞体外成熟的影响。本研究采用玻璃化冷冻法对GV 期和 MII 期卵母细胞进行冷冻保存，结果表明，冷冻后GV 期和MII 期卵母细胞的形 态正常率分别为51%和66%，与对照组92%和90%相比差异极显著（P0.01）。冷 冻后GV 期成熟率为43%，与对照组90%相比差异极显著（P0.01），说明冷冻保 存对卵母细胞有一定的损伤，影响其后续发育能力。 2.冷冻对卵母细胞CD9 表达影响。采用免疫荧光法，对CD9 在GV 期和MII 期牛卵母细胞冷冻前后表达进行定位分析，结果显示，CD9 在GV 期和MII 期牛 卵母细胞冷冻前后均有表达。再用免疫印迹法，检测CD9 在GV 期和MII 期牛卵 母细胞冷冻前后的表达量，结果显示，均检测到24 kD 的CD9 蛋白。进一步灰度 分析的结果显示，在鲜MII 期卵母细胞CD9 表达量最高，其次为冷冻MII 期卵母 细胞，GV 期冷冻卵母细胞表达量最低。说明冷冻保存影响CD9 的表达，而且CD9 表达量随卵母细胞发育成熟而增加。 3.CD9 抗体及玻璃化冷冻保存对精卵结合和融合的影响。用CD9 单克隆抗体 处理成熟卵母细胞，统计分析精子结合卵子数和精子穿卵率发现，实验组（每卵 粘附数 2.2±0.4，穿卵率26%）明显低于对照组（每卵粘附数6.0±0.3，穿卵 率88%），差异极显著（P0.01），并且呈剂量依赖性，说明卵母细胞膜蛋白CD9 参与精卵结合和融合。GV 期冷冻-解冻卵母细胞成熟后IVF 结果显示，实验组（每 卵粘附数 3.0±0.3，穿卵率40%）明显低于对照组（每卵粘附数6.0±0.3，穿 卵率88%），差异极显著（P0.01）。MII 期冷冻-解冻卵母细胞IVF 结果显示，实 验组（每卵粘附数3.2±0.4，穿卵率52%）明显低于对照组（粘附数6.0±0.3， 穿卵率88%），差异极显著（P0.01）。试验结果表明，玻璃化冷冻保存卵母细胞 不但影响其CD9 表达，而且对其早期发育阶段损伤程度更为严重。 关键词：牛卵母细胞；玻璃化冷冻；CD9；表达；精卵结合和融合 The Expression of CD9 in Bovine Oocytes Before and After Cryopreservation and Its Effects on Sperm-Oocyte Interaction Abstract CD9 is a membrane protein that involved in cell adhesion, migration, proliferation and differentiation processes. Sperm-oocyte binding and fusion are very important processes in mammalian fertilization, in this process CD9 plays an important role. With the development of in vitro fertilization - embryo transfer and cryopreservation techniques, cryopreservation technique in animal germplasm pr