花生四烯酸细胞色素p450羟化酶参与高血压形成及正常血压维持实验研究.pdf

华中科技大学同济医学院博士论文 中文摘要 /2t}.lV.} ,-n分s点降CYP4A1基因。大鼠CYP4A1cDNA开放阅读框 153dbp，编码由510个氨基酸组成的多肤分于。我们根Mi;LEN)FI(Genbank) 上大鼠CYP4A1序列设计一对含有EcoRI及SalI的引物，应用RT-PCR 技术从Sprague-Dawley(SD)大鼠肾脏中逆转录得到CYP4A1含有开放阅读 框的全长的cDNA，并利用EcoRI及SalI酶切位点克隆到pBluescript(PBS) 载体。限制性酶切鉴定正确后测序，与Genbank上所载CYP4A1序列相比 较发现第1021位碱基对的G-A。在突变位点处设计另一对引物，将这对 引物分别与用于克隆CYP4A1的一对引物配对，以经过测序含有第 1021 位突变碱基的PBS4A1为模板，用PCR分别扩增CYP4A1的5端和3 端两个片段，通过变性，退火后互补的部分结合在一起，在DYNAzymeDNA 聚合酶作用下，两条部分互补的单链分别以对方为模板，即合成了校正突 变碱基的CYP4A1开放阅读框全长的cDNA，再以此为模板进行PCR扩增 反应，扩增产物经再测序确认为完全正确的含有CYP4A1开放阅读框的全 长cDNAa 在本研究的第二部分中，我们将第一部分通过RT-PCR克隆得到的正确 的CYP4A1基因，亚克隆至真核表达载体peDNA3.1构建成pcDNA3.1-lAI 和pcDNA3.1anti4A1重组体。然后经舌下静脉转染SD大鼠(2mg/kg), 尾动脉测压法测定大鼠的收缩压，并用Westemblots和Northernblots从 CYP4A1蛋白表达及转录水平，分析转染正义和反义CYP4A1cDNA后的大 鼠脑、心、肺、肝、肾CYP4A1的表达水平。结果发现注射正义和反义CYP4A1 cDNA重组体的大鼠二周后，与给予空载体pcDNA3.1(2mg/kg)的对照组 相比，平均收缩压分别增加 1.8士0.3kPa(13..2士2.5mmHg)或降低 1.7土 0.3kPa(13.0土2.2mmHg)。在转录水平和翻译水平Northernblot和Western blot均证实脑、心、肺 CYP4A1的表达几乎没有改变，转染的 pcDNA3.1·4A1和pcDNA3.1·anti4A1mRNA在肾脏中选择性地表达， 华中科技大学同济医学院博士论文 中文摘要 而在转染4A1组，肾脏4A1表达显著增高，相反在反义4A1组则CYP4A 表达几乎完全被抑制。 在第二部分，我们用质粒作载体，初步观察了正义 CYP4A1和 反义 CYP4A1对大鼠血压的影响。山于外源性DNA在体内很容易被核酸酶消化， 效应持续时间短，因此第三部分我们用:AAV载体携带CYP4A1全长cDNA 转染大鼠研究持续高效表达4A1时对血压的影响。将CYP4A1基因利用 HindIII酶切位点克隆至rAAV载体中，构建UF3.4A1,UF3anti4A1重组 体，然后与包装质粒pXX2,辅助质粒pXX6按摩尔比为1:1:1的比例通过 磷酸钙沉淀的方法共转染293细胞，完成rAAV·4A1,rAAV·anti4A1的 包装。收获病毒后，用已知分子数的相应目的基因片段作对照，将病毒DNA 及对照DNA片段固定于尼龙膜上后进行杂交分析。用斑点杂交的方法确定 病毒的滴度，通过比较对照DNA片段和病毒DNA斑点密度的大小，来确 定被印迹的病毒DNA的分子数，进而确定病毒正、反义4A1·rAAV及 LacZrAAV，的滴度。然后从舌下静脉分别转染rAAV4A1,rAAVanti4A1 给SD大鼠及自发性高血压大鼠(SHR)5X10 “个病毒颗粒/只，通过尾 动脉测压法测定大鼠的收缩压，并用Westernblot和Northernblot检测大鼠 脑、心、肺、肝、肾CYP4A1的表达水平。结果发现注射 rAAV ·4A1, rAAVanti4A1五周后，与rAAVLacZ的对照组相比较，平