蛋白芯片和组织芯片介绍.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * 哈佛大学的MacBeath等设计了一系列研究蛋白质间相互作用的芯片。选择三对相互作用的蛋白质: Ⅰ、 蛋白质G（Protein G）和免疫球蛋白（IgG）; Ⅱ、 核因子NF-κB复合物中的p50和NF-κB抑制因子IκBα; Ⅲ、 FKBP-rapamycin结合蛋白（FRAP）的FKBP12-rapamycin结合域（FRB）和人immunophilin FKBP12蛋白，这二种蛋白质的结合作用需要小分子rapamycin。将各对蛋白质中的第一种同时点样于醛基化玻片，每种蛋白质重复四个点，制备5张芯片，分别与不同荧光标记的配体蛋白质杂交反应，结果与预期一致：偶联BODIPY-FL荧光素的IgG或Cy3- IκBα只能检测到其各自作用的蛋白质 G或p50。而且，只有加入rapamycin后，Cy5标记的FKBP12才能与FRB蛋白质样点作用产生荧光信号，说明固定于芯片上的蛋白质保持了功能活性（图14-5）。由于BODIPY-FL、Cy3、Cy5三种荧光素互不干扰（发射光谱不重叠），所以可将三种荧光素标记的探针混合进行杂交反应，然后分别选择三种荧光素的特征波长检测。 * * * * * * * * * * * * * * Sales of protein chips will exceed $700 million in 2006, a 10-fold increase from the $76 million in sales the industry recorded one year agoBioInsights Report on Protein Chips, March 2002 * * 组合化学是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机器人结合为一体的技术。它根据组合原理在短时间内将不同构建模块以共价键系统地、反复地进行连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库(Compound-Library)；然后，运用组合原理，以巧妙的手段对化合物库进行筛选、优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。 * * * Aptamer的修饰—抵抗核酸酶 RNA库经2’位的修饰，具有了核酸酶抗性，可用于分析含有核酸酶的体液中的靶分子 DNA具有较好的稳定性，修饰和未修饰的DNA Aptamer均已用于体液中靶分子的分析 Aptamer结合的特异性 目前已经报道筛选出特异配基的靶分子多达几十种，而且特异性极强。 茶碱是缓解哮喘的药物，但有毒副作用，需定期检查血清中的含量以防毒副作用的发生。茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似，而后两者常存在于血清中。 常规的茶碱单抗检测有交叉反应，而通过SELEX方法筛选到的寡核苷酸配基仅特异结合茶碱，与其他两中物质均无反应。其中与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10 000倍。 Aptamer的结构 Aptamer大小一般在10～15碱基，这些寡核苷酸配基常存在于一些分子间结构中，如发夹、口袋等结构，能形成稳定的空间结构。 配基与靶分子的结合部位的平均大小为30～40nm。 Aptamer的特性 与单克隆抗体相比 ①作用的靶分子范围更广，除金属离子、有机染料、药物、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽可以作为寡核苷酸配基的靶分子外，完整的病毒颗粒和细菌病原体也可以通过复合靶SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基； ②与靶分子的结合具有比抗体更强的特异性和亲和力，且不受组织或样品中非靶蛋白的干扰。如上述茶碱的例子； ③能克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原免疫动物所受的限制； Aptamer的特性 ④ 在体外筛选，不需经过体内(动物、细胞)体系，筛选出的配基在体外合成，较单抗制备具有简单、快速、便宜、纯度高等优点； ⑤筛选出的配基在合成时，可以精确、定点、随意连接其他功能集团和分子，如巯基、氨基、荧光素、生物素及酶等； ⑥ 寡核苷酸配基在变性条件下分离纯化，性质稳定，变性的配基可很快复性，可长期保存和室温运输。 Aptamer与蛋白芯片 双位点结合试验（夹心法） 抗原/抗体夹心法是目前最常用的诊断模式。在分析中被测物被夹在两个适配体之间，一个配体用于捕捉，另一个用于检测。 Aptamer在夹心分析中即可用作捕获适配体，也可用作检测适配体。 Aptamer与蛋白芯片 Aptamer与蛋白芯片 但到目前为止，核酸配基尚不能同时发挥捕捉和检测两方面的作用，所以基于Aptamer的夹心分析都是用一个抗体作为第二配体。 Aptamer竞争结合配体（抗原）的相同部位，而难以找到两个结合位点不同且没有重叠的Aptamer 。这是由SELEX过程本身决定的。SELEX过