第11章 固相膜免疫测定.pptVIP

第十二章　 固相膜免疫测定 常彩红 免疫学教研室 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。 　第一节 概述 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 B与F分离 四、固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便 五、常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜 六、固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6 μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性 固相NC膜 第二节　免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。 一、胶体金制备 　胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。 胶体金的制备及特性 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 一、免疫渗滤测定(IFA)——双抗体夹心法测抗原 IFA——结果判断 二、免疫层析测定（ ICA ） ICA 试剂条 ICA 结果观察 IFA与ICA的比较 三、斑点酶免疫吸附试验 ——Dot-ELISA 四、酶联免疫斑点试验—— ELISPOT 20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。 ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 ELISPOT结果判断 五、免疫印迹法——Westernblot法 六、放射免疫沉淀试验 重点 Company name 免疫浊度测定 Ag + Ab AgAb + Ab 标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F） 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 　抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab 　Ag * Ab Ab* Ab* Ag + Ag + Ab* Ab Ab 535 紫色 0.70 71.5 525 红色 1.00 41 522 橙红色 1.50 24.5 518 橙色 2.00 16 lmax(nm) 呈色 （ml)* （nm) 胶体金特性 1%柠檬酸钠加入量 胶体金粒径 *还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量 膜固相免疫测定的特点 滥用药物 心肌标志 肿瘤标志