基因片段的亚克隆（DNA酶切、回收和连接）.pptVIP

基因片段的亚克隆 (DNA的酶切、回收和连接） 一.实验目的 掌握DNA酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握DNA片段胶回收的方法 ?? 二.实验原理 1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。 2.DNA的酶切反应 分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～8bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末端或平端。 3. DNA的连接 在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步： T4DNA 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 三.? 试剂与器材 〈一〉试剂 限制性内切酶EcoRI, HindIII ；10×内切酶缓冲液 T4DNA连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE） 琼脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5μg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水 Note:? Concentration:??20,000 and 100,000 units/ml. Assayed on lambda DNA Storage Conditions:??250 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5mg/ml BSA, and 50% glycerol. Store at -20°C Diluent Compatibility:??Diluent B Heat Inactivation:??65°C for 20 minutes Not sensitive to dam, dcm or mammalian CpG methylation Conditions of low ionic strength, high enzyme concentration, glycerol concentration ?5% or pH 8.0 may?result in star activity 双酶切buffer的选用 〈二〉实验器材 1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备 2．恒温水浴槽 四. 操作步骤 酶切反应 设计酶切体积为20~30μl，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装； 先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10x酶切缓冲液，混匀； 在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； 加入适量的DNA样品； 弹匀，短暂离心； 置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大; 置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行; 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; 反应体系： 10×内切酶缓冲液 2?l DNA 1-1.5?g 限制性内切酶 2-5单位 用灭菌的ddH2O补至20?l，37℃ 1小时。可根据需要按比例放大。 pGFPuv和pBSK的酶切体系： 酶切体系 质粒载体（pGFPuv和pBSK） 10×RE buffer (E) 6 ?l 100×BSA 0.6 ?l DNA 6 ?g EcoR I 0.6 ?l Hind III 0.6 ?l ddH2O X ?l → 合计60 ?l 充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37℃保温3-4小时或过夜，65℃保温10分钟使限制性内切酶失活。 五.注意事项 酶的定义: 在标准条件下,1小时完全消化1μg线型DNA分子所需的酶量定义为1U； 影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质； 识别序列