实验六：小鼠精巢细胞减数分裂标本的制备与观察.pptVIP

实验六：小鼠精巢细胞减数分裂标本的制备与观察 【背景知识】 示意图 一、减数分裂I 二、减数分裂II 实 验 目 的 学习滴片法制备单细胞悬液染色体的一般方法。 以小鼠精巢细胞染色体制片为标本观察减数分裂过程中不同时期的染色体。  【试验原理】 小鼠曲细精管管腔 曲细精管管腔 【实验材料及用品】 实验试剂  【实验操作】 【实验操作】 【实验操作】 【实验操作】 【注意事项】 【结果观察】 作业： 骨髓细胞的收集 1、来源丰富、个体较小的小动物骨髓细胞收集法： （1）处死动物，取长骨 （2）去干净骨上所附肉（先用刀片刮，再用纱布擦） （3）用剪刀剪开骨头两端 （4）用注射器吸生理盐水或低渗液将骨髓腔中细胞冲出，收集到离心管中 2、大动物骨髓细胞收集：骨髓穿刺法取红骨髓 羽髓细胞的收集 培养血细胞的收集 （1）用吸管先将培养液转入离心管中（10ml带刻度） （2）再给培养瓶中加入生理盐水，用吸管吸取瓶中生理盐水冲洗整个培养瓶底壁，将附着在底壁上的细胞（主要为淋巴细胞）冲洗下来转入培养液所在离心管。 * * 减数分裂（Meiosis）是发生于生殖细胞的一种特殊的细胞分裂方式，DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子。 减数分裂远比有丝分裂复杂，经两次细胞分裂，分别称减数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ，两次分裂间又一个较短的间期，这个间期DNA不复制。 1、前期I 减数分裂的特殊过程主要发生在前期I，通常人为划分为5个时期：①细线期（leptotene）、②偶线期（zygotene）、③粗线期（pachytene）、④双线期（diplotene）、⑤终变期（diakinesis）。 终变期：二价体显著变短，并向核周边移动，在核内均匀散开。 2、中期I 3、后期I 4、末期I 可分为前、中、后、末四个四期，与有丝分裂相似。 雄性动物精子发生于睾丸曲精细管的生精上皮细胞，由其中的精原细胞经多次有丝分裂和生长，形成初级精母细胞，初级精母细胞经减数分裂形成次级精母细胞，次级精母细胞有丝分裂成精细胞，再经一系列变化成精子。 因此，通过分离曲细精管、剪碎并加入液体吹打，可使官腔各种细胞游离出来，然后经过低渗、固定、染色等过程就可制成包含减数分裂各期的标本。 1、? 材料：成年雄性小白鼠 2、? 用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀（普通剪刀、眼科小剪刀）、吸管、离心管、离心机、玻片等。 1、100?g/ml秋水仙素。 2?、? 2％柠檬酸钠溶液 3、?? 0.075M的KCI 4、3?1甲醇?冰醋酸及1?1甲醇?冰醋酸（应现配） 5、 PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 6、Gimesa原液 7、 Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS缓冲液，混匀。工作液应现用现稀释。 1、注射秋水仙素，增加中期分裂相。 试验前4－5小时，小鼠腹腔注射秋水仙素0.5ml（100?g/ml）。 2、取睾丸并清洗。 断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，放入盛有4－5 ml 2％柠檬酸钠溶液的平皿中清洗并去掉外面脂肪等物，弃污液。 3、挑出曲细精管并剪碎。 另加柠檬酸钠溶液1ml，用尖头镊尖或解剖针将曲细精管拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。 4、游离并收集细胞。 将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中，用吸管反复吸打1－2min，使尽量多的细胞从管腔中游离出来； 静置5 min（或300rpm离心2 min），使大的膜管状杂质下沉； 吸上清液于另一管中，1000 rpm离心5 min，沉淀即为不同发育阶段的细胞。 5、低渗处理，使细胞胀大。 加入5ml 0.075M的KCI，轻轻（为什么？）吹打混匀，静置10 min。 6、预固定。 向离心管中加入1ml 3?1甲醇?冰醋酸，轻轻吹打混匀，静置2 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 7、固定。 向上述沉淀中加入5ml 3?1甲醇?冰醋酸，吹打混匀，静置10－20 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 8、再固定。加5 ml 1?1甲醇?冰醋酸，吹打混匀，静置5 min，1000 rpm离心8min，弃上清，加3－4滴1?1甲醇?冰醋酸固定液悬浮细胞。 9、滴片。 滴一滴细胞悬液于冰水中刚捞出的湿载玻片上，自然干燥。 10、染色。 Gimesa染液染20-30 min，流水洗去多余染液，待干 1、收集尽量多的细胞 2、加入低渗液后一定要轻轻吹打，以免细胞核提前破裂，引起染色体外遗、无规则排列。 3、滴片时玻片一定要带水 4、注意染色。 观察各期细胞核及染色体。 绘