实验六动物细胞传代培养.pptVIP

细胞工程实验动物细胞培养部分 实验三 动物细胞传代培养 一、实验目的 1. 使学生在细胞培养方面获得进一步的感性知识； 2. 学习动物细胞传代培养基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态特点。 二、实验原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。 三、实验材料 1、仪器与用品：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、灭菌高压锅、培养瓶或培养板、吸管、移液管。 2、材料：、SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）、肺癌细胞。 3、试剂：DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰酶、PBS。 四、基本操作训练（一）贴壁细胞的传代培养 将培养的贴壁细胞（如肺癌细胞）于5%CO2、37℃培养箱内培养，直至细胞生长铺满支持物表面时，即可进行细胞的传代培养。 吸出或倾倒出细胞培养支持物培养皿或细胞培养瓶内的培养液，加入适量无菌PBS溶液，轻轻晃动培养皿或培养瓶，以去除残余的血清（因为血清中含有抑制胰蛋白酶作用的蛋白组分）。 于培养支持物内加入适量0.25%胰蛋白酶液（一般1.0ml~2.0ml），以能浸润培养皿或培养瓶细胞生长表面为限，进行胰酶消化处理。 约2~5分钟后，倒置显微镜下观察，当贴壁细胞松动、细胞质边缘卷起出现间隙时，快速向培养皿或培养瓶中加入适量DMEM-15%牛血清完全培养液（胰酶处理液的10倍左右），以终止消化。 用吸管或滴管轻轻吹吸，使附着细胞完全从培养表面内完全脱落，制成细胞悬液。 按1:3~1:10的比例，将细胞悬液等份分装到数个新的培养皿或培养瓶中。 于扩增的培养皿或培养瓶中补加适量新鲜配制的DMEM-15%牛血清完全培养基溶液，拧上盖子，盖子稍松（以便气体流入充分），放置于5%CO2、37℃培养箱内培养，进入下一轮的传代培养或进行其他实验。 （二）悬浮细胞的传代培养 将培养的悬浮细胞细胞（如杂交瘤细胞）于5%CO2、37℃培养箱内培养，直至细胞生长至对数期时，即倒置显微镜下观察细胞书目明显增多、细胞周边圆滑，即可进行细胞的传代培养。 用吸管或滴管轻轻将培养支持物细胞培养板的细胞吹起或将培养瓶内的细胞轻轻摇晃，制成细胞悬液。 按1:3~1:10的比例，将细胞悬液等份分装到数个新的培养板或培养瓶中。 于扩增的培养板或培养瓶内补加适量新鲜配制的DMEM-15%牛血清完全培养基溶液，拧上盖子，盖子稍松（以便气体流入充分），放置于5%CO2、37℃培养箱内培养，进入下一轮的传代培养或进行其他实验。 五、结果观察 1、细胞传代前后的生长状况及速度的观察； 2、了解生长良好、一般及较差细胞的显微镜下观察。 六、注意事项 1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作； 2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿； 3、传代时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个人实践经验而决定； 4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉强为之。 七、实验报告  1、.原代细胞和传代细胞培养有哪些区别? 2、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。3、原代细胞和传代细胞培养的体会。 * *