杂交瘤技术-细胞融合.pptVIP

杂交瘤技术（hybridoma technique） 安徽医科大学微生物学教研室 内容纲要 细胞融合 概述 诱导细胞融合的常用方法 杂种细胞的筛选（HAT） 杂交瘤技术与单克隆抗体的制备 基本概念 三个技术关键 单克隆抗体的制备过程 杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。 1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。 一、细胞融合（cell fusion） 1、概述 细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。 可在自发或人工诱导下发生。 两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。 2、诱导细胞融合的常用方法 生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合 （1）仙台病毒融合法 常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用最为广泛。 因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。 （2）聚乙二醇融合法 聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融合。 其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒法。? （3）电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞膜被击穿而导致细胞融合。 其优点是： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。 3、杂种细胞的筛选 人工诱导细胞融合是一个随机的过程，可能产生多种类型的细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 应根据其细胞特性来选择适当的筛选方法（如酶缺陷、药物抗性标记、营养缺陷、温度敏感等）。 HAT是最常用的筛选系统 原理 细胞DNA合成有两条途径： 主要合成途径 补救合成途径 主要合成途径 即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进而合成DNA。 这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。 补救合成途径 细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。 H—hypoxanthine （次黄嘌呤）A—aminopterin （氨基喋呤）T—thymidine （胸腺嘧啶核苷） DNA的生物合成途径与HAT选择培养基 凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）； HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的杂交细胞，可在HAT培养基上存活。 HGPRTˉ细胞的筛选 可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。 由此可见，HAT选择培养基及补救合成途径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后选择出杂交细胞株的关键因素。 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备 （一）基本概念 杂交瘤细胞 指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，又具有参与融合的体细胞的一些特征。 杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。 单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 克隆 指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。 McAb技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在