2014年基因工程 核糖核酸酶技术 英文文献.pptVIP

刘丽丽 112310005 一、RNA i RNAi( RNA interference ，RNA干扰)：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。 1、RNAi 的基本过程 2、RNA i的机制 细胞自然存在二种干扰RNA siRNA（短干扰RNA）：19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导mRNA降解。 microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成，抑制mRNA翻译。 二、锌指核酸酶技术 1、锌指（zinc finger ）：一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基元，主要存在于作为转录因子的DNA结合结构域模体中，通常由约20多个氨基酸残基组成，可形成指形的环，其中有2个半胱氨酸和2个组氨酸(或4个半胱氨酸)残基螯合锌离子。 2、锌指核糖核酸酶 三、同源重组和非同源末端连接 1、同源重组（Homologus Recombination）发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 1、材料和方法 3、讨论分析 * Targeted mutagenesis in the silkworm Bombyx mori using zinc ?nger nuclease mRNA injection siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白—argonaute 家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。 ZFN 由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成 DNA识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基 与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kimetal.1996) FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性,每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点。当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到 DNA 定点剪切的目的。 从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。 图1 锌指结构对DNA进行识别 图2 锌指结构对DNA切割并导入新的DNA片段 2、非同源末端连接（Non-homologous End Joining NHEJ)真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂（Breaks)的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。它是目前仅见的一种修复DNA双链断裂的手段，也是和同源重组并重和相互补充的一种DNA双链断裂的修复手段。NHEJ不需要同源重组断端之间的具有严格的DNA之间的同源性，不是一种忠实的DNA双链断裂修复方式。 把两个DNA断端相邻区域进行“基因沉默”（基因沉寂）处理( 需要组蛋白N端尾部结构域9位赖氨酸残基的甲基化以及和Sir2/3/4等蛋白形成以染色质而避免出现在断端处的基因转录） DNA末端识别和结合蛋白Ku70、Ku86等蛋白质的保护作用，以及包括Mre-11/Rad50-Nbs1(人类细胞）或Srs2(酵母细胞）等具DNA酶活性的蛋白复合体对涉及到结合有蛋白质的DNA断端进行的加工处理（DNA酶的加工主要是去除与DNA断端共价连接的蛋白质或因为离子辐射等造成的损害的核苷酸残基而出现彼此具有“粘性”的末端） 通过DNA连接酶ERCCIV把两者彼此连接最终引发彼此毫不相干的DNA断端的连接。 NHEJ过程 哺乳动物细胞DNA双链断裂的非同源末端连接 Introduction Materials an