“绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用.docVIP

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原 创 性 声 明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也 不包含为获得贵阳中医学院或其他单位的学位或证书而使用过的材 料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确 说明。  作者：  日期：  年  月  日  关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位 论文；学校可根据国家或贵州省有关部门规定送交学位论文。  作者签名：  导师签名：  日期：  年  月  日 “绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用 贵阳中医学院硕士论文 题目：“绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用 作者：夏铭 导师：孔德明 教授 学位：硕士 学校：贵阳中医学院 中文摘要 目的: 本课题旨在使用转基因和绿色荧光蛋白示踪技术，建立活体 “绿色”胰 岛β细胞转基因斑马鱼模型；在此基础上初步探索结合化学遗传学方法靶 向清除破坏胰岛β细胞。胰岛β细胞破坏模型的建立为活体高通量筛选胰 岛β细胞再生的小分子化合物和中草药奠定了研究基础。 方法: 利用分子克隆和显微注射方法建立绿色荧光蛋白标记的胰岛β细胞转基 因斑马鱼系；PCR 技术、全胚胎原位杂交和活体成像技术，从 DNA，RNA 和蛋白质三个水平证实 GFP 的表达可以特异性反映内源性胰岛素的表达 情况；遗传学方法进一步建立胰岛 β 细胞破坏的活体转基因斑马鱼动物 模型。 结果: 1、用酶切鉴定正确的重组质粒 p-IsceI-INS:nfsB-GFP 进行显微注射，建 立胰岛β细胞转基因斑马鱼系。 2、荧光筛选获得生殖系稳定遗传的 F1 代胰岛β细胞转基因斑马鱼。PCR、 全胚胎原位杂交和活体成像分别从 DNA，RNA 和蛋白质三个不同的水平证 实外源性基因 INS:nfsB-GFP 整合进入斑马鱼基因组。 3、连续动态监测活体斑马鱼胰岛β细胞发育情况。从受精后 24h 脊索中 线位置上单个细胞层的厚度到受精后 48 小时胰岛β细胞由中线向右迁 移，形成不对称的分布。受精后的 120 小时，胰岛β细胞最终形成了一个 第 1 页 共 1 页 “绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用 贵阳中医学院硕士论文 右位器官。 4、10mM 甲硝唑与转基因斑马鱼胚胎共同孵育 48 小时，nfsB 蛋白将无毒 性的前体药物转变为细胞毒素，在活体直接破坏胰岛β细胞。 结论: 1、通过转基因技术，建立活体可视化“绿色”胰岛β细胞发育的转基因 斑马鱼系。 2、运用全胚胎原位杂交和基因组 PCR 技术证实 GFP 对胰岛β细胞可靠的 示踪性和稳定的基因组整合。 3、通过化学遗传学方法，初步建立了胰岛β细胞破坏的活体斑马鱼动物 模型。 4、本研究成功构建的可示踪胰岛β细胞破坏的活体转基因斑马鱼系，为 进一步研究胰岛β细胞再生，以及整体动物水平上筛选具有胰岛β细胞再 生的小分子化合物和中草药提供了一个重要的新型模式生物。 关键词: 斑马鱼;胰岛β细胞;转基因;INS;nfsB;GFP; 第 2 页 共 2 页 “绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用 贵阳中医学院硕士论文 Transgenic zebrafish with green pancreatic beta-cell and their application ABSTRACT Objective: Using transgenic technologies and green fluorescence protein（GFP） tracing, we have established a“green” pancreatic β-cell zebrafish model, in which the green pancreatic β-cell can be targeted for ablation by the administration of a prodrug. This model provides a excellent animal model to allow us to screen small molecular and TCM that promote the regeneration of pancreatic β-cells. Methods: Molecular cloning and microinjection were used to analyze the β-cell de