第四章动物细胞的微囊化培养.pptVIP

动物细胞大规模培养存在的困难 1、动物细胞生长速率慢，产物的生产率也低，从而造成产物浓度也低。 2、动物细胞培养基成分复杂，价格昂贵。 3、动物细胞没有细胞壁，易受机械搅拌所引起的剪切力的影响。 4、常规的细胞培养方法也不太适用于大规模培养。 上述这些限制造成了大规模动物细胞培养所需费用高，技术难度大（规模越大、影响也越大）。 随着生物工程的发展，使得很多原先只有动物体产生的蛋白质可由重组微生物生产，如重组大肠杆菌表达和生产人胰岛素和人生长激素。然而，由于微生物细胞缺乏蛋白质的转录后修饰机制，由重组微生物产生的不少蛋白质分子不具有所期待的生物学功能和活力。 动物细胞的大规模的培养确有不小的困难，但它的优点也是很明显的、诱人的，关键是如何提高细胞在反应器内的密度，提高细胞的稳定性以及生产率。动物细胞的固定化以及培养是解决问题的有效途径。 微囊半透膜的孔径 是培养基营养成分、代谢物进行膜内外交换、截留一定分子量蛋白在囊内的关键，如何选择是一重要问题。 微囊的膜是多阴离子的海藻酸与多阳离子的聚赖氨酸相互作用而形成的。研究表明，此半透膜的孔径主要由聚赖氨酸的分子量决定，一般来说用高分子量的聚赖氨酸(PLL)覆膜孔径大，PLL分子量低、孔径小，通常使用相对分子量为40000-80000的PLL。研究还表明，PLL溶液的浓度及处理时间、溶液的PH及使用温度也都会影响膜的孔径。 微囊的质量 海藻酸的纯度、黏度及甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的比例都会影响微囊的形成及机械性能。纯度高、黏度高容易成囊。 含古罗糖醛酸多的海藻酸容易成囊，机械性能好，不易破碎。因此在使用海藻酸时必须慎重地选择。 细胞的活性 在进行微囊化时要注意到保持动物细胞的存活率，这与微囊化时间的长短、温度、溶液的pH、保持溶液等渗等都有着密切的关系，需特别注意。 微囊化时动物细胞在海藻酸溶液中的初始浓度也与存活率有关，不同的细胞，所用浓度不同，一般在104～106个/ml （2）脱乙酰几丁质/海藻酸钠微囊 用1g/L的脱乙酰几丁质（pH6.5)代替PLL/ALG法中的PLL，在脱乙酰几丁质与海藻酸钠反应20min后，再用0.05mol/L柠檬酸钠处理，使微囊内重新液化。膜的孔径受脱乙酰几丁质溶液的离子强度的影响，此法同样也存在强度不够的问题。 （3）PLL/脱乙酰几丁质/海藻酸钠双层膜微囊 包有细胞的海藻酸钠凝胶珠与脱乙酰几丁质溶液反应成膜后，用生理盐水洗涤再加入到0.3g/L海藻酸钠中反应4min，再经生理盐水洗涤，与0.5g/L的PLL（相对分子量22000）反应6min以稳定膜，同样可以形成微膜。 （4）脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素（CMC）微囊 利用脱乙酰几丁质与CMC的静电作用形成半透膜使细胞微囊化的方法。 将含有细胞的羟甲基纤维素钠盐（CMC）溶液经微囊发射器喷射入脱乙酰几丁质溶液中，反应2-5min，然后倒入磷酸缓冲液中以减少几丁质的粘度，用离心的方法收集微囊、培养。 （5）甲基丙烯酸乙基脂/甲基苯烯酸甲酯（HEMA/MMA）共聚物微囊 HEMA/MMA、PEG600和细胞溶液6.7:60:33.3的体积比混匀后，经过空气套筒的针头喷入碳酸二乙酯中，形成悬浮液与生理盐水混合，温和搅拌，使微囊完全形成并沉淀。 在微囊内，很多动物细胞，不管是悬浮细胞还是贴壁细胞都能良好地生长。据报道，仅杂交瘤细胞就有100多种已被微囊化培养。 重组成纤细胞HBS-1在贴壁生长时，细胞呈棱形单层生长，而微囊化后形态发生了很大的变化，由棱形变成了球形，并且呈三向实体生长，逐渐成团，与动物体内的组织形态很相识，这可能反应了微囊的微环境比较接近动物体内的环境。 二、培养条件 1、培养容器：小规模的用到转瓶、方瓶等。大规模培养用摇瓶和生物反应器。 2、培养基：DMEM,RPMI和EMA 3、微囊的大小：微囊小，物质的传递迅速，营养物和氧气可以很快地进入微囊内，以供给细胞生长所需要，同时代谢产物也能及时地排放到微囊外面。当PLL/ALG微囊的直径超过500μm 时，细胞的增殖受到明显的抑制。 4、微囊的体积和工作总体积之比：通常在（1：10）～（1：2）的范围内。他们间的比值大则生产等量产品可减少生物反应器的体积。对大规模生产是非常有利的。 5、可以加大搅拌速度和通气量，但要注意不破坏微囊。 一、生产药物上的应用 1、单克隆抗体的生产 3、干扰素的生产 Jarvis和Grdina通过试剂和病毒方法诱导微囊化FS-1和Namalwa细胞生产干扰素，这两种细胞在微囊中生产比悬浮培养或单层培养更旺盛，两细胞在微囊中生产的干扰素与悬浮培养或单层培养的总产量相同。 二、在治疗及药物筛选上的应用 1、人工器官 微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍的意义。人们已将某种器官的细胞微囊化并植入体内