2010实验1质粒DNA的提取.pptVIP

质粒DNA的提取和鉴定 实验一 一、目的与要求 1.掌握碱裂解法提取质粒的方法及原理 2.了解用分光光度计测定DNA含量的方法 3.了解“过柱”快提质粒DNA 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 　三、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 碱裂解法 基本原理： 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来 实验过程 1.利用变性后状态不同：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。 2.利用溶解度的不同：将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。 3.利用离心力的不同：通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中， 4.利用酚变性结果不同：然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。 质粒DNA的提取方法 方法： 碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法， 质粒DNA释放法； 酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污 剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 选择哪种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、 大肠杆菌菌株、 裂解后用于纯化的技术 实验要求 四、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、 台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、 LB液体培养基，氨苄青霉素 （三）试剂： 溶液I作用： 分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II作用： 细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III作用： 酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性 DNA沉淀，K＋可中和DNA 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用： 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）。 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇： 除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液： 溶解DNA 五、实验步骤 （一） 细菌培养与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上 （活化菌种），37℃过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡， 250 r/min 过夜培养。 3. 从中取4毫升种子菌液于含 LB 培养基中（含 Ap），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）。 （二）质粒提取 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4℃，30sec。 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡。 7. 向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 9. 50μL TE缓冲液，使DNA完全溶