生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术.pptVIP

* * * * * * * * 實驗 P1 * 實驗 P1 * 說明文字 * 說明文字 * 說明文字 * * * * * * * * * 架膜 加盖 接导线，开机 3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白 电泳仪器 实验操作： 浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。 点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳 将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。 染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。 漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。 4.等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF) 原理 Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。 EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的、稳定的、线性的pH)。 原理（续） 当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。 只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。 方法（EF的关键） ⑴载体两性电解质CA 分辨率0.01pH ⑵固相pH梯度 以具弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物 CH2＝CH─CO─NH─R R=─COOH R=─4级氨基 R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系 体系分辨率达0.001pH pH梯度范围最窄可为0.01pH/cm CAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子；在电场中,CA迁移到自己的pI而形成pH梯度. 5.电泳技术问题及对策 1).低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间会发生相互静电作用,增加溶液离子强度可减少这种作用,但会提高电泳时的电流,使产热更多,温度升高又促进蛋白质的扩散,使区带变宽,分辨率下降.因此电泳缓冲液的离子强度必须控制适当。 0.02-0.2M 的离子强度 离子强度低,速度快,发热低,有电渗 离子强度高,速度慢,发热大 电泳技术问题及对策 2).蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的pH值,应仔细调整和控制电泳缓冲液的pH值,使各组分分子的净电荷数差异加大.但极端pH下蛋白质会变性失活,因此一般控制在pH4.5～9.5之间; 电泳技术问题及对策 3). 缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用,因此必须根据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统; 电泳技术问题及对策 4).表面活性剂(SDS等)强烈破坏蛋白质分子间的非共价作用,使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围,阻止了蛋白质之间的相互作用,同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差异; 电泳技术问题及对策 5).控制电泳介质的有效黏度,包括选择适当的凝胶孔径和添加能增加介质黏度的物质; 电泳技术问题及对策 6).电泳过程发热量的控制: 发热的难题：蛋白质变性;蛋白质区带扩散,分辨率下降; 对策: 减少发热:降低电流,提高电压;提高传热表面积;提高材质的传热系数;提高冷却系统的温差. 减少扩散:增加缓冲系统或介质的黏度可以减少扩散;在微重力作用下进行电泳; 思考 什么是等电点电泳?什么是等电聚焦电泳?二者的主要差别在什么地方? * * * * * * * 說明文字 * 說明文字 * * * 前 言 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。 电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 1.电泳技术的基本原理 u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分) V:泳动速度:cm/秒or分 E:电场强度:伏特/cm d:泳动距离:cm t:电泳