液相色谱柱原理及使用.pptVIP

（4）特别提醒：再生时最好选择不具备在线脱气的独立泵送系统 色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪 器精密部件。 3.2正相色谱柱（Normal –Phase Chromatography column） 3.2.1氨基柱（-NH2） ①在正相条件下使用时，故障率较低。但要注意不可进样含有醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量较差的乙醚、四氢呋喃等溶剂中含有少量）。任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用异丙醇过渡。 当使用氨基柱进行酸性物质分析时，酸性物质溶液有质子存在，会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后被测成分保留性质有所改变或柱效下降。这时，建议按如下方法处理： 首先用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积→然后用甲醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积→再用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约10倍柱体积过渡，回到平常使用的正相流动相平衡2h，进样检测即可。若上述方法不凑效，可尝试按以下程序冲洗与再生： 首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积→然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积以洗去多余NH3→再用添加少许NH3（如0.1％）的酸性分析物的流动相平衡2h左右，进样检测即可。 ②在反相条件下使用时，-NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱效会下降很快，所以故障率较高。若出现柱压增高柱效降低等情况，建议采用如下方法处理： 若流动相含有缓冲盐，先以流动相比例的水-有机溶剂，以检测分析时同流速冲洗约30倍柱体积→再用纯甲醇，以1.0ml/min流速冲洗约50倍柱体积→然后用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积过渡→再用二氯甲烷以0.6ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积→再用异丙醇以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积过渡回到甲醇条件下，以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱体积，密封保存或用流动相平衡2h左右（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水-有机相以1.0ml/min流速冲洗约30min），进样检测即可。若上述方法不凑效，可尝试如下程序冲洗与再生： 3.4手性柱（Chiral HPLC Column） 手性色谱柱在使用过程中往往会由于操作不当而导致一系列问题，现以AGP柱为例加以说明和规范。 （1）常见故障原因及处理办法： ①手性异构体无法完全分离：多为色谱条件不妥，需要重新考察色谱条件。 ②峰形变差，诸如拖尾、分叉、前延：多为色谱柱污染、柱床硅胶溶解与柱头塌陷（往往是由于流动相pH超过8.0或流速及柱温选择不当导致）、柱床干涸等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。 ③柱压升高到100bar以上：多为色谱柱污染、柱头塌陷等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。 （2）再生补救措施： 手性柱若用时过久，在保证色谱条件正确与操作得当的情况下，若出现上述故障，可尝试按如下程序再生： 清洗筛板、更换柱头硅胶→反接色谱柱，用纯水以0.2ml/min流速冲洗约4h→用25%异丙醇溶液以0.2ml/min流速冲洗过夜→再顺接色谱柱，用纯水以0.2ml/min流速冲洗约6h→再用25%异丙醇溶液以0.2ml/min流速冲洗约1h→然后用纯水以0.5ml/min流速冲洗约2h→再用流动相平衡约2h（若流动相中含有缓冲盐，需先用水-有机相，按流动相同比例同流速冲洗约30min），进样检测即可。[备注：手性柱价格昂贵，而再生结果多具有较大不确定性，要么成功要么报废，因此，请谨慎进行手性柱的再生!] （3）备注：部分品牌手性柱（eg.YMC CHIRAL NEV手性柱）用纯乙腈保存，通常在反相条件下使用。当出现柱压增高、分离度降低与峰形变差时，需要进行必要的处理。 1）若为柱头污染，清洗程序如下：反接色谱柱，不接检测器，用流动相冲洗约20倍柱体积→用纯水冲洗约20倍柱体积→正接色谱柱，接或不接检测器，用纯水冲洗约20倍柱体积→接检测器，用流动相平衡至基线平稳，进样测试；若不能解决问题，则需要拆卸筛板清洁（程序同反相柱），必要时更换筛板。 2）若为强保留物质污染，清洗与再生程序如下图所示：（其中①～⑤一般在正接色谱柱时进行；若不凑效，再反接色谱柱同程序进行。均需冲洗至少20倍柱体积。） 流动相平衡至基线稳定，进样测试。 ① 水 四