棉花真菌病害拮抗菌株抗性成分分析及相关基因片断克隆.pdf

澎冻次次-}p大学硕星留灵 2005卒6刀 中文摘要 棉花是世界上种植面积最大的工业原料作物。我国是世界产棉大国，棉花生 产的兴衰对国民经济的发展具有重大意义。目前世界上危害棉花生产的病害主要 有棉花立枯病、炭疽病、棉铃疫霉病、棉叶斑病、棉花枯萎病及棉花黄萎病等， 其中以棉花枯萎病、黄萎病尤为严重。棉花黄萎病(CottonVerticilliumWilt)是棉 花生长过程中最具毁灭性的病害之一。其致病菌大丽轮枝菌(VerticilliumDahliae Kleb,后文中简称助分类学上属半知菌亚门((Deuteromycotina),淡色抱科轮枝菌 (Verticillium)，其特点是分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间 久，是一种极难防治的土传病害，被称为棉花的癌症。棉花枯萎病(Cotton FusarinmWilt)是棉花生产上危害最大的检疫性病害之一 多年以来，科学家针对棉花黄、枯萎病生物防治做了大量的研究工作，虽己 取得很大的进展，但这方面的研究依然存在不少问题。其中最主要的问题是棉花 黄萎病生物防治措施效果不够稳定，仍没有一个成功应用于大批量生产和推广的 拮抗微生物。目前己有防治其他作物黄萎病的生防制剂商品，但还未见报道登记 注册的防治棉花黄、枯萎菌的生防菌。 本文采用抑菌圈法及平板拮抗法从湖南、广西、北京等地采集的辣椒、黄瓜、 烟草等根际周围土样中筛选到85个对棉花黄萎病和枯萎病有拮抗作用的微生物 菌株。又经复筛后得到15个拮抗性较好的菌株，选择两株抗性最好的菌株A6, A7进行了进一步的研究。其中A6对棉花黄萎病、枯萎病的拮抗率分别为46.3 %和56.7%,A7对棉花黄萎病、枯萎病的抑菌率分别为44.7%和48.2%。经检 测发现，A6,A7对棉花黄萎病有拮抗作用的物质分别在培养18和20小时达到 顶峰。通过16srDNA及Microlug-Biolog初步确定A6和A7为解淀粉芽抱杆菌。 为了了解菌株拮抗病害的初步机理，本试验通过对A6,A7的拮抗物质检测 发现:菌株本身、其挥发性提取物、非挥发性提取物、非蛋白提取物和蛋白质提 取物对棉花黄、枯萎病均有拮抗作用，其中非挥发性提取物作用最明显。A6的 挥发性代谢产物对棉花枯、黄萎病的的抑菌率分别为50.0%,17.6%,A7的挥 发性代谢产物对棉花枯、黄萎病的的抑菌率分别为33.3%,55.6%eA6的非蛋 白提取物对棉花枯、黄萎病的抑菌率分别为28.6%,42.3%,A7的非蛋白提取 物对棉花枯、黄萎病的抑菌率分别为23.7%,38.7/0x,而非挥发性提取物处理后， 两种病原菌几乎不能生长。 本文研究了A6和A7的蛋白粗提液经温度和酶处理后的拮抗性。A6,A7 的蛋白粗提液经40℃以下处理时拮抗能力与粗提液相当，40℃以上处理时，随 着温度的上升拮抗能力越来越弱，当处理温度达到100℃时，几乎已经没有了拮 抗能力。A6的蛋白粗提液经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后对棉花黄萎病的拮抗率 澎菊a它业式学动tiE_t 1005卒 ‘刀 为原来的133%和176%，对棉花枯萎病的拮抗率为原来的58.3%和154%;A7 的蛋白粗提液经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后对棉花黄萎病的拮抗率为原来的的 200%和160%，对棉花枯萎病A7的拮抗率为原来的112%和80.5%o 本试验进行了蛋白质的分离纯化，并检测了纯化后蛋白质的拮抗作用。经 SepbadexG-100纯化得到三条主要蛋白峰，经检测其中峰1具有拮抗活性，SDS 电泳检测峰I为单一的蛋白。 限制酶Sau3AI识别G“ATC，四核昔酸专一位点，本试验通过人工控制酶切 条件，部分酶切Sau3AI位点，使其片断在3-7Kb之间。用试剂盒回收目的片 断，连接到PGEM-3Z上，转化至JM109。然后通过蓝白斑筛选及平板拮抗法筛 选，从近万个白斑中筛选到两株对棉花黄、枯萎病有拮抗作用的重组菌株，测序 得到大小都为4.7Kb的片段C3和C4，在genbank中没有与C3和C4同源性高 的序列，但是C3和C4的同源性为99.73%,C3和C4编码的蛋白与Rhs蛋白家 族都具有26%的同源性，且通过分析C3和C4确实存在Rhs蛋白ORF。但是 Rhs蛋白的功能目前尚不清楚。