检测新城疫病毒和禽流感病毒的双重RT-PCR方法的建立.pdfVIP

塑塑苎：垫型堑塑丝堕量型鱼堕壁堕量堕翌重!!：望生查垦堕垄皇———上 检测新城疫病毒和禽流感病毒的 双重RT-PCR方法的建立 硕士研究生： 杨旭芹 导 师： 圜教授 刘秀梵教授 中文摘要 disease virus，NDV)引起的 新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle 禽类急性、高度接触性的传染病，是目前危害我国养禽业最严重的疫病之一。禽流 influenza 感(Avian virus，AIV)是由A型流感病毒属的禽流感病毒引起的禽类的 一种烈性传染病。特别是高致病性禽流感，一旦爆发，将会给中国和世界其它很多 国家养禽业造成相当严重的经济损失。目前检测NDV、AⅣ的方法有病毒分离 法、血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验等。但这些方法存在 费时、费力、操作烦琐、敏感性不高或特异性不强等缺点。 PCR是近几年发展成熟起来的一种体外基因扩增技术，具有灵敏、特异、快 速、准确和易于操作等优点。多重PCR技术是一项特殊的PCR方法，它对混合感 染病原体的鉴别检测只需一次PCR反应，就可同时鉴别多种病原体，这不仅节约 昂贵的生物试剂，还简化了程序，加快了检测诊断速度，具有很高的临床应用价 值。 本研究根据Genebank中发表的新城疫病毒和禽流感病毒的基因组序列，利用 同源性比较，设计筛选出两对双重RT-PCR反应的特异性引物，其中一对是新城疫 病毒的通用引物。扩增出大小约为550b0片段：另一对为禽流感病毒的通用引物， 法，并用琼脂糖电泳鉴定PCR产物，结果证明所扩增的产物均为特异性的核酸片 段。在单一RT-PCR方法的基础上，进行引物浓度，退火温度等反应条件的优化 扬卅I大学硕士学位论文 II 扩增出禽流感病毒和新城疫病毒两种不同大小的特异性片段，并对该反应条件进行 了优化。应用该多重RT-PCR方法对AIV和NDV人工混合感染的鸡胚尿囊液、临 床样品进行检测，_并与病毒分离法进行比较，特异性试验以传染性支气管炎病毒 RT-PCR全部阳性，非特异性对照样品经RT-PCR检测全部阴性。对人工混合感染 出22份阳性；并检测了16份棉拭子和组织赃器样品，RT-PCR检出9份阳性，病 毒分离出5份阳性。分别提取AIV和NDV的RNA，并测其含量，将病毒核酸连 PCR诊断方法的敏感性要高于病毒分离方法，且大大的缩短了检出时间O,k样品 处理到完成RT-PCR反应，整个实验过程可在8h内完成)，表明该方法具有高度的 特异性和灵敏性，且节约时间，可从分子水平对禽流感病毒和新城疫病毒进行早期 快速诊断和流行瘸学调查。 PCR方法检测 塑塑堡!塑型堑整壅塑童塑鱼亟壁堕塞塑翌垩翌二坠!查鎏塑壅皇 一!里． Newcastle and Virus ofAvianInfluenza Detection Virus RT-PCR DiseasebyDuplex Technique M．S．Candidate：XuqinYang Advisor：Prof． Prof．XiufanLiu Abstract Avian influenza