甲基对硫磷降解菌的筛选及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆.pdfVIP

摘要 有机磷农药作为一类高效广谱豹杀虫剂自从上世纪40年代发明以来，已在全世界范围内人面 积使用。在半个多世纪里，这类杀虫刹增加了农作物的产量，为人类社会的发展做出了重要的贡 献。但是随着有机磷农药解长期帮大范围使用，越来越多的环境闷题，人类健康问题，入类可持 续发展问题开始凸显出来。有机磷降解酶可以破坏有机磷农药分子的磷脂键，最终使其脱毒。因 瑟，通过基因工程技术生产高效、廉价具有广谱特性的有机磷降筋酶制剂是疆前瀵除有机磷农药 污染的最有潜力的方法。 本研究从农药厂被农药长期高度污染的土壤中通过富集培养分离得到一株能够降解甲基对硫 基对硫磷水解酶MPHxW。 通过保守区设计筒并引物，PCR扩增缛到该甲基对硫磷水织酶基因的部分片段。避过将已知 序列在网上进行比对，进而设计特异引物克隆得到甲基对硫磷水解酶基因mphxw全长。编码基因 酸残基为信号默序列，蛋囊矮理论分子藿为35kD。编码基冈的核蛰酸廖捌分析表明，虽然该基因 少一个氮基酸。阉时该基因与本实验塞先前报道的OPHC2相似性非常低，只有43．7％。mphxw 已经在GenBank串登录，登录号是毯U596456。 将不带有信号肽的编码序列分别构建了原核表达重组载体pET-mphxw和真核表达重组载体 pPIC9丫-mphxw，暇核表达产物具有正常生物学动髭。同时也筛选捌了一揽能够分泌表达甲基对硫 磷水解酶真核重组子。 从原菌Ochrobactrum sp．M231和原核表达重组子中纯化了该基因的原菌蛋白和原核重组蛋 自，对纯化的原菌蛋白进行了质谱分析表明，分离纯亿的原菌蛋白和从该菌中克隆得到基因表达 蛋白的序列是一致的。对原菌蛋白和原核重组蛋白的酶学性质进行了测定，发现在最适反应温度 和最适会反应麟上，两个蛋白都基本耀戗，分剃在∞℃稿pH9-{O黠近。遴过热稳定性_帮翊稳 定性的研究比较发现，原核熏组蛋白比原菌蛋囱具有更好的热稳定性和pH稳定性，原荫蛋白的比 活高，为148U／rag，比原核重组蛋白商了30倍以上。 下一步希望逶过对MPHXW和OPHC2这两个楣似性很低，酶学性质差舅|j犬的甲基对硫磷永 解酶基因在分子结构上进行比较研究，希望能够在解释甲基对硫磷水解酶热稳定性以及催化机理 上有新酶突破。 关键词：甲基对硫磷水解酶，苍白杆菌，基因克隆，酶学性质 Abstract in efficient whichwereinvented1940sare usedas Organphosphorus(OP)compoundswidely highly to ofhuman and insecticides．OPshavemadecontributionthe society broad—spectrum great development thehalfofa andmore aboutenvironment dudng century．However,moreproblems pollution，human healthandconfinuable toCOlileout with andwideuseofOPs． developmentbegin Mong long—time call O—Pbondof the ofOPsis OPs，and OrganphosphomshydrolasedesWoy consequentlytoxicity eliminated．Theof efficientand