蛋白酶凝乳特性研究试验指导书10.docVIP

“蛋白酶凝乳特性研究”实验指导书 指导教师：刘海臣 1.实验目的 通过研究胃蛋白酶、木瓜蛋白酶作用于脱脂乳的最适凝乳温度、最适pH值、以及金属离子对酶凝乳效果的影响，使学生掌握酶学研究的基本方法，从而掌握生物化工研究的一些基本理论和主要思路，为科研开发打下必要的基础。 2.实验原理 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有很强的蛋白质催化特性，又具有良好的凝乳特性。因脱脂乳含大量酪蛋白，木瓜蛋白酶的凝乳特性主要表现为随机切割精氨酶-苯丙氨酸的肽键，达到破坏蛋白质稳定的效果，进而发生凝乳。奶酪的生产以前主要利用牛凝乳酶达到凝乳效果，但牛凝乳酶主要是从小牛的第四胃中提取得来，其来源受到极大的限制，通过研究蛋白酶、木瓜蛋白酶的凝乳特性并对其进行优化，一定程度地缓解凝乳酶来源的紧缺状态。 3.实验材料、仪器和试剂 3.1实验材料 优质脱脂乳 3.2实验药品和器皿 药品（器皿）名称 产品规格 产品数量 备注 胃蛋白酶 100G 2 Sigma公司 木瓜蛋白酶 15万～50万活力单位 800g 脱脂乳 450g 3 分析纯 氯化钠 500G 2 分析纯 氯化钙 500G 2 分析纯 氯化镁 500G 2 分析纯 盐酸 500ml 2 分析纯 氢氧化钠 500G 2 分析纯 器皿 恒温水浴锅 规格不限 4 同时开5组实验 试管 φ15mm×100mm 100 开5组实验 三角瓶 100ml 60 开5组实验 秒表 规格不限 4 开5组实验 量筒 100ml 4 开5组实验 吸管 5—10ml 4 开5组实验 吸耳球（移液枪） 规格不限 4 开5组实验 pH计 规格不限 4 开5组实验 3.3试剂 （1）配制浓度为100g/L的脱脂乳1000ml,混匀后待用。（5组） （2）配制浓度为10g/L的木瓜蛋白酶液和浓度为2g/L胃蛋白酶溶液各500ml，混匀后待用。（5组） （3）配制0.1mol/L NaOH和0.1mol/L的HCl溶液各1000ml,用于调节溶液pH值。（5组） 4.操作步骤 4.1木瓜蛋白酶（胃蛋白酶）凝乳活力的测定　 取 5mL100g.L-1的脱脂乳,在65℃下保温5min,加入0.5mL10g.L-1的木瓜蛋白酶液（或胃蛋白酶液）,迅速混合均匀,准确记录从加入酶液到乳液凝固的时间(s)。把40min凝固1mL100g.L-1的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhletunit),并以相对活性(RU)表示各因素的影响效果。SU=（2400/T）×（5 / 0.5）。式中:T为凝乳时间(s) RU(％)=（各因素下SU / 最大SU）×100 4.2酶的最适凝乳温度的测定：分别在55,60,65,70, 75℃下测定酶凝乳活性。 4.3酶的热稳定性：酶液分别在55 ，60，65,70,75℃下处理10,30,60min后,测定酶的凝乳活性。（上述温度对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距） 4.4 pH对酶凝乳效果的影响：用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH将100g/L的脱脂乳的pH调到6.0,6.5,7,7.5，8在65℃下测定酶的凝乳活性。 4.5 酶对pH的稳定性：用0.1mol/L HCl和0.1moL/LNaOH将酶液调到pH为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,室温下(约25℃)放置1h后,再将酶液pH调到6.0,在65℃下测定酶的凝乳活性。（上述pH对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距） 4.6 NaCl对酶活的影响：在酶液中添加0.2,0.5,0.8,1.1,1.5 (%)浓度的NaCl溶液，分别测定酶的凝乳活性。 4.7 Ca2+、Mg2+、K+对酶凝乳效果的影响：在乳液中添加CaCl2,MgCl2、KCl使其含量分别为0.2,0.5,0.8, 1.1,1.4 (%),然后测定酶的凝乳活性。（上述离子对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距） 五. 实验要求 通过酶学实验研究，找出木瓜蛋白酶、蛋白酶的最适温度、最适pH值、最适底物浓度以及那些金属离子对蛋白酶具有抑制作用、哪些离子具有促进作用。画出趋势图或用表格加以说明。最后写出总结报告，内容类似于研究论文（包括题名，摘要、关键词、前言和正文部分，最后还要有结论部分以及参考文献等）。另外，实验前务必提交预习报告，否则不予参加实验。 2