枣疯病植原体的分子检测及鉴定的研究.pdfVIP

摘 要 枣树原产我国，属于我国的特产果树。近年来，我国枣树的栽培面积不断扩大，使 得枣产业在新疆果业中占有一定分量。然而，在生产上对枣树及果品影响的因素有很多， 其中枣疯病是枣产业发展的主要限制因素。枣疯病被称为枣树的癌症，具有毁灭性，目 前虽然出现一些治愈方法，但是其效果不太明显。本文基于以往的研究基础，根据 Lee 设计的通用引物R16mF1/R16mR1 对植原体 16S rDNA 进行 PCR 扩增，获得其目的片段， 通过 BLAST 比对，DNAman 软件分析，根据保守区域设计多对引物，通过实验筛选适 合的引物，优化 PCR 扩增体系及条件，建立了枣疯病植原体的检测体系。利用该检测 体系，对新疆部分主栽品种进行带病情况调查。具体研究的内容和结果如下： 1．根据植原体 16S rDNA 通用引物 R16mF1/R16mR1 ，对陕西和山西具有枣疯病植 株的总 DNA 进行 PCR 扩增及测序，分别得到 1432bp 和 1433bp 的两条序列，DNAman 分析比对结果表明二者同源性为 99.37% 。挑选27 条关于 16S rDNA 具有明确分组的植 原体序列，进行同源性分析，以此为基础，选择 17 种具有 16S rDNA 分组的典型的限 制性内切酶，通过 pDRAW32 软件计算机模拟 RFLP ，结果表明枣疯病植原体的酶切图 谱都一致，与其他组的酶切图谱均存在差异，其中最大的为 9 处差异，最小的为 3 处差 异。分析同源性并绘制系统进化树，结果表明来自陕西和山西的枣疯病植原体的 16S rDNA 片段和 16S rDNA V-B 组的遗传距离最近，应该划分到 16S rDNA V-B 组中。故 确定枣疯病植原体 16S rDNA 属于 16S rDNA V-B。 2 ．对获得的 16S rDNA 序列，通过 BLAST 获得与其相似的序列 99 条，DNAman 软件分析其同源性，得到枣疯病植原体的保守序列，运用 Primer 5.0 针对保守序列设计 引物，运用 BLAST 检测这些引物，是否只扩增植原体 16S rDNA，剔除可以扩增出其他 菌体的引物序列，筛选出只扩增植原体序列的 NTF1/NTR1 、NTF2/ NTR1 、NTF3/NTR1 、 NTF1/NTR2 、NTF2/NTR2 和 NTF3/NTR2 六对引物序列，确保实验不出现假阳性现象。 通过实验进一步筛选，挑出适宜的 PCR 检测体系的引物 NTF1/ NTR1 、NTF1/NTR2 、 NTF2/NTR2 、NTF3/NTR2 四对，克隆测序检测扩增片段，证明所检测到的植原体均符 合预测结果，并均属于枣疯病植原体的 16S rDNA 片段，保证实验的准确性。通过对枣 疯病植原体总 DNA 稀释 10-50 倍，发现总 DNA 浓度在该范围内对该检测体系几乎没有 影响，说明检测的灵敏性比较好，可以很好地用于枣疯病植原体的检测。 3 ．利用建立起来的枣疯病植原体PCR 检测体系，对在新疆采集的梨枣，灰枣，金 丝小枣，冬枣和骏枣等样品进行检测，结果发现在喀什地区采集的有枣疯病症状的骏枣 样品中存在有植原体，在库尔勒地区采集的无枣疯病症状的部分骏枣和脆枣样品中也被 检测出有植原体存在。因此，要求我们必须对新疆枣疯病病情进行深入的调研，搞清疆 内枣树携带植原体的情况，确保枣树产业健康发展。 关键词：枣疯病；PCR ；植原体；分子检测；同源性； I Abstract Jujube is origin from China, and is an important species of fruit tree ．Recently, with the cultivation areas expansion, the Jujube industry occupies an important proportion in Xinjiang ．However, the growth of Jujube and fruit quality was affected by many factors ． The main limiting factor was Jujube witches’-broom (