鸡恒定链活性片段和NDVF蛋白表位嵌合体制备及鉴定.pdf

摘 要 恒定链Ii(Inv盯iallt chain)是一种非多态性的II型跨膜糖蛋白，由胞浆区、跨 膜区和内质网腔区三部分组成。恒定链在脊椎动物中作为MHCII类分子成熟的分 子伴侣，在协助MHCll分子递呈抗原过程中起重要作用。恒定链基因属单拷贝基 因，但存在异构体形式。恒定链上有许多功能活性片段，如胞浆区的两个亮氨酸 基序具有内体定位功能，跨膜区的序列参与膜的锚定和促进三聚化的形成，内质 网腔区的CLIP能占居MHCII类分子的肽结合槽，阻止内源性抗原肽的结合。三聚 化区形成三聚体与MHCII类分子结合，作为其装配的支架，CL工P区前还有促进抗 原肽加载到肽结合槽的Ii—key基序。越来越多的研究证明Ii是一个多功能分子， 如工i与MHCI类分子，与新生儿Fc丫受体和与血管紧张素工I受体的相互作用被发 现；除在免疫调节中的作用外，还在应用研究中有所发现，如利用工i的内体定向 作用作为抗原的载体，用优势的抗原表位置换Ii的CLIP区，利用外加CLIP来增强 免疫应答，利用Ii的抑制和工i的沉默技术。目前有两种机制能解释Ii调节抗原肽 加载到MHC工1分子上的功能：首先，Ii被降解留下CL工P区结合在抗原肽结合槽中， 上称为别构位点的部位结合，使抗原肽结合槽保持开放直到新抗原肽结合在抗原 肽结合槽里，这段序列称为Ii—key；美国antigenexpress公司将Ii—key与抗原表 位通过连接臂相连形成Ii—key嵌合肽疫苗与单独用表位免疫获得了显著的免疫 增强效果。 新城疫病毒可引起禽类发病，一旦染病会给养鸡业造成巨大的损失。融合 蛋白是NDV表面一种重要的囊膜蛋白，在NDV病毒免疫中扮演重要的角色，实验室 成员己将NDVF48E9强毒株融合蛋白上三个潜在的抗原表位串联成F306，其免疫 原性得到增强，但多肽疫苗的应用受到MHc限制性，抗原性弱，表位置换难，持 续时问短等限制，有必要对F306进行改造。 随着鸡，鸭，鹅，鹌鹑等禽类工i基因的克隆，通过序列比对在Ii中发现了一 为研究禽类Ii—key(LQRK)是否具有免疫增强作用，以及鸡恒定链的其它片段的 功能，我们用恒定链上部分片段对取白新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F蛋白)的 串联表位F306进行修饰，为进一步比较经鸡恒定链部分功能片段修饰的表位与未 的DNA序列设计到引物上，以pGEX一4T—l／F306为模板，PCR扩增获Ii—key／F306、 I i—key／F306、 i—key／F306／AP片段，插入至|J质粒pET一32a，而得pET一32a／I 转化进宿主菌，诱导表达，从PAGE胶中纯化重组蛋白。进一步将构建的五个重组 95％以上。本研究所构建的修饰表位可通过原核表达大量制备，切胶纯化蛋白纯 度高，为动物免疫试验奠定了物质基础。 关键词：鸡恒定链，NDV，F蛋白，嵌合体，原核表达 Abstract 1heinVariaIltchain is a (Ii) non-polymo印hict)，pe。Ⅱ it consistsofthreedomains： domain． glVcoprotein’ cytoplasmic domainandlumenaldomain．Iian roleasa forMHCII playsimponant chaperone maturationandf．acilitates invertebrates．^isa antigenpresemation single．copygene are butitscDNAand moleculeshavesomeisoforms．There