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构建转基因鱼类细胞以快速检测环境污染物的遗传毒性 摘要 细胞内的p53信号通路可以感受DNA损伤信号，激活并上调胞内p53蛋白 的活性和水平，而p53蛋白则诱导一系列与细胞周期停滞、DNA修复和凋亡相 关的下游靶基因的表达，从而使细胞周期停滞，给细胞足够的时间修复DNA损 伤；如果DNA损伤太严重而无法修复，则诱导细胞凋亡，从而保证了基因组 蛋白的下游靶基因，参与细胞周期停滞的诱导。在本研究中，我们将表达质粒 鱼牙鲆鳃细胞系FG中，从而成功构建了一种用来检测环境污染物或化学药品的 遗传毒性的转基因鱼类细胞遗传毒性检测系统，这种细胞命名为p21FGLuc。当 遗传毒性物质引起p21FGLue细胞发生DNA损伤时，萤火虫荧光素酶的报告基 因就会被转录激活并表达，而海肾荧光素酶报告基因是组成型表达，起到内对照 的作用，降低实验误差。因此，该转基因鱼类细胞遗传毒性检测系统是利用双荧 光素酶报告基因检测技术，通过检测环境污染物或化学药品处理后，是否能诱导 p21FGLue细胞的相对荧光信号(萤火虫荧光信号／海肾荧光信号)提高，来达到 检测遗传毒性的目的。 本文首先对FG细胞的转染条件进行了优化，结果表明，FG细胞的最佳转 LTXPLUS最好，对FG细胞的毒性最小， 染条件为：转染试剂Lipofectamine 转染效果最好；24孔板转染时，DNA总量为500 ng时可以得到最好的转染效果； 在共转染实验中，表达质粒与内参质粒在5：1时，荧光蛋白的表达信号最强。 其次，本文将携带有人p53基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因的质 粒和人p21基因的启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因的质粒，分别共转染到 细胞，并检测荧光蛋白的表达情况，来确定FG细胞内的p53信号通路的完整性。 结果表明，FG细胞具有完整的p53信号通路，表达野生型p53蛋白，而且牙鲆 p53的蛋白可以识别人启动子p21，并激活与这个启动子相连的萤火虫荧光素酶 基因的表达，这是本文利用该细胞系建立遗传毒性检测系统的先决条件。 再次，本文检测了FG细胞对G418的抗性，确定了G418对转染后FG细胞 8筛 进行筛选的最佳浓度是600 lxg／ml。并通过G41 lxg／ml，维持筛选浓度为300 的比例共转染到FG细胞后，得到了稳定转染细胞：p21FGLuc。 最后，本文通过具有不同毒性作用机制的遗传毒物和非遗传毒物处理该细胞 p21FGLuc，以验证该遗传毒性检测系统在检测环境污染物或化学药品的遗传毒 性上的特异性、灵敏度和可靠性。结果表明，该遗传毒性检测系统，能高效应答 C)对细胞DNA的损 遗传毒物博来霉素(bleomycin)和丝裂霉素C(mitomycin 伤，并且表现出明显的剂量效应和时间效应关系，但是对非遗传毒性物质酒精 (ethan01)却没有应答反应；对遗传毒性物质的应答，该系统的反应很迅速，而 且在不同的处理时间段内，所诱导的报告基因的表达很稳定；在相似的细胞毒性 C) 处理组。这表明，该转基因鱼类细胞遗传毒性检测系统具有很好的特异性。 邻苯二甲酸--(2．乙基己基)酯(DEHP)是一种增塑剂，是目前世界上最广泛存 在的环境污染物之一。DEHP在细菌、酵母和哺乳动物细胞遗传毒性检测系统中 以及微核和染色体畸变实验中，均显示阴性结果，但是DEHP可引起啮齿类动物 肝脏致癌。本文的p21FGLuc细胞对DEHP的遗传毒性检测结果为阳性，首次提供 了DEHP具有遗传毒性的实验证据，但是具体作用机制尚待进一步研究。在环境 应，在50 的遗传毒性上比其它系统要灵敏得多。环磷酰胺本身没有致突变作用但是在体内 经肝脏代谢后就会产生具有烷化作用的代谢产物，可引起DNA损伤。由于大多 数的细胞不具有代谢活化的能力，因此在体外实验中，这类间接致突变物需要用 S9复合物激活