蟾蜍毒素诱导卵巢癌OVCAR3细胞M期阻滞硕士论文.pdfVIP

中文 摘 要 前 言 {卵巢癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤。由于卵巢癌早 期诊断困难，70一80%卵巢癌患者在发现时已进人晚期，单采用手 术治疗不能提高卵巢癌患者的5年生存率，治疗须化疗和手术治 疗相结合。当前治疗卵巢癌的一线联合化疗是以铂类药物为基 础，主要方案有CAP(环磷酞胺、阿霉素、顺铂),CP(环磷酞胺、顺 铂),PT(紫杉醇、顺铂)，除静脉给药外，还可腹腔局部注射给药， 缓解率较前明显提高。然而仅有30一50%卵巢癌患者达临床缓 解，10一30%达病理完全缓解。因此，开发新的药物进行卵巢癌化 学治疗是卵巢癌治疗研究的热点之一。蟾蛛毒素作为中国传统中 药由于具有强心、麻醉、解毒、止痛等药理作用已被广泛用于临床。 含蟾赊毒素成份的中药复合制剂治疗肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、直 肠癌及白血病等的临床观察提示，有效率在26.3一69%。李风云 等用含蟾蛛毒素的中药制剂治疗肝癌300例，发现肝癌肿块明显 缩小，提高了癌症晚期患者的生活质量。张芬琴等用蟾蛛丸(以 蟾蛛皮烘干研粉装人胶囊)予白血病诱导化疗后患者长期口服， 观察10例，7例坚持长期服用，存活最长达11年(1例)，最短7年 (3例)，余为8年。由于蟾蛛毒素治疗恶性肿瘤多数为复合制剂 的辅助治疗，尚未见到多中心的，大样本的临床比较研究。因此， 蟾蛛毒素治疗肿瘤的确切疗效及适应症尚未明确。关于蟾蛛毒素 本身的抗肿瘤作用，YamadK等报告，经两次维甲酸诱导治疗缓解 后的早幼粒白血病病人再次复发，他们将其细胞进行原代培养，单 独加人维甲酸出现耐药，而加人蟾赊毒素成分之一蟾毒灵(bufa- lin)后维甲酸诱导分化作用又重新恢复，提示bufalin在原代培养 中能逆转耐药的早幼粒白血病细胞对全反式维甲酸的敏感性。 Zhang和Jing等报告10nmoVL的bufalin可抑制白血病K562细胞 的生长，同时诱导K562细胞向粒系细胞分化，诱导HL60,U937, MM细胞向单核/巨噬细胞系分化。肿瘤不同分化标志如形态、 组化、吞噬植物乳液颗粒能力、四哇氮蓝还原能力、F。受体产生的 检测证实bufalin的诱导分化作用为不可逆性。LeeDY等报道，5 一20nMbufalin对淋巴毛细血管形成抑制率为45.3%一75.6%. Akiyama等实验研究发现，bufalin能抑制皮肤磷状上皮细胞癌生 长。这些结果表明，蟾赊毒素作用广泛。迄全内井，蟾赊毒素对卵 巢癌的作用及作用机理在国内外尚未见报导护本研究的目的是采 用卵巢癌OVCAR3细胞株为研究对象，研究蟾蛛毒素对卵巢癌细 胞的抑制作用及其对细胞周期的影响。 / 实验材料 (一、器材:37、培养箱、37、水浴箱、流式细胞仪(FACScan BectonDickinsonUSA)、倒置显微镜、光学显微镜、细胞涂片离心 机、离心机。 二、药品:蟾赊毒素是采用特殊工艺分离中华蟾赊皮肤分泌腺 的分泌物，溶于二甲亚枫液中，配成50mg/rnl原液，4℃保存。使 用前生理盐水稀释。经实验证明二甲亚枫的终浓度低于0.5% 时，对细胞生长没有抑制作用。胰酶(购于北京奥博星生物技术 责任有限公司),RPMI1640(购于GIBCO)、胎牛血清(购于天津血 液研究所)。 三、细胞培养:人卵巢低分化乳头状腺癌OVCAR3细胞生长 在含10%胎牛血清、121U/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中， 3790、体积分数为5%CO:条件下贴壁培养。细胞倍增时间为24 小时。所有实验均采用对数生长期细胞。 实验 方 法 一、细胞增殖能力测定:将OVCAR3细胞经消化液(含0.2% 胰酶和0.2%EDTA的磷酸盐缓冲液)消化后、1208离心5分钟收 集细胞、磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，调整细胞浓度至5x1少 细胞/ml，接种于6孔板，2rn1/孔。预培养6小时，待细胞完全贴 壁，加人0.01一1.0}Lg/ml蟾赊毒素继续培养，分别于24,48,72 小时将细胞经消化液消化后，用台盼兰拒染色法测定活细胞数，计 算生存率，细胞生存率=加药组存活细胞数/对照组存活细胞数x 100%。 二、集落形成实验:细胞经不同浓度蟾蛛毒素处理1小时、6 小时，用PBS洗去药物，梯度倍数稀释，配制成1x103细胞/ml细 胞悬