腺苷同型半胱氨酸水解酶的表达纯化及活性测定方法建立.pdfVIP

国际检验医学杂志2013年6月第34卷第12期 IntJLabMed，June2013，Vo1．34，No．12 · 基础实验研究论著 · 腺苷同型半胱氨酸水解酶的表达纯化及活性测定方法建立 许秀丽 。，周建平 ，刘 培 ，郝庆钦 ，温新宇 ，王 玲 ，田亚平 △ (1．中国人民解放军总医院生化科，北京 100853；2．南开大学医学院，天津 300071) 摘 要 ：目的 获得高纯度的重组 腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)，并建立其活性测定方法。方法 运用基 因工程技 术 ，在大肠杆菌系统中原核表达重组 SAHH，经过镍亲和层析和 SephadexG15两步纯化 ，得到 目的蛋 白对其进行理化性质鉴定， 并通过优化活性测定条件，确定 sAHH活性测定方法 。结果 终产物 sAHH 纯度为 95 ，相对分子质量为 49000，比活性为 1615U／mg。在 37℃、pH7．5的HEPES缓冲液 中反应 20min为酶活性测定最佳条件 ，抑制剂可有效抑制酶活性 。结论 通过 基 因重组技术可获得高纯度 的SAHH，产物理化性质 良好 ，活性测定方法成功建立，为循环酶法测定 同型半胱氨酸工艺稳定放大 提供可循依据 ，并且为 sAHH抑制剂科学研究提供一种可靠的方法。 关键词 ：腺苷 同型半胱氨酸水解酶 ； 亲和层析 ； 生物活性 ； DTNB显色 DOI：10．3969／j．issn．1673—4130．2013．12．004 文献标识码 ：A 文章编号 ：1673—4130(2013)12-1500—03 Expression andpurification ofadenosylhomocysteinehydrolaseand establishmentofitsactivitydeterminationmethod XuXiuli ，ZhouJianping ，LiuPei ，HaoQingqin ，WenXinyu ，WangLing 。TianYaping (1．DepartmentofBiochemistry，GeneralHospitalofChinesePeoplesLiberationArm ，Beijing100853，China； 2．NankaiUniversitySchoolofMedicine，Tianjing300071，China) Abstract：0bjective ToobtainhighpurifiedrecombinantS-adenosylhomocysteinehydrolase(SAHH)andestablishitsactivity determinationmethod．Methods GeneticengineeringtechnologywasadoptedtoexpressrecombinantSAHH inE．coliprokaryotic expressionsystem．Thetargetproteinwasobtainedviatwo—steppurificationincludingnickelaffinitychromatographyandSephadex G15，anditsphysicalandchemicalpropertieswereidentified．SAHH activitydeterminationmethodwasestablishedthroughoptimi— zingtheconditionofactivitymeasurement．Results ThepurityofendproductsSAHH was95 with relativemolecularmassof 49000andthespecificactivityof1615U／mg．Theconditionof37℃ ，pH7．5HEPESbufferand20minutesreactionwasoptimum forSAHH activitydetermination．SAHH inhibitoreffectively inhibiteditsactivity．Conclusion High purifiedSAHH canbeob— tainedthroughrecombinantgenetictechnolog