大肠杆菌O157%3aH7新分子伴侣的预测、表达、纯化及其相互作用蛋白的初步筛选.pdf

摘 要 I 摘 要 摘 要 EHEC O157:H7 是一种重要的危害严重的肠道致病菌，它主要通过III 型分 泌系统 （type III secretion system ，TTSS ）将毒力蛋白直接注入宿主细胞发挥致 病作用，是许多革兰氏阴性致病菌中存在的复杂的分子装置。TTSS 分子伴侣是 TTSS 的组成部分，对底物（效应蛋白或转位蛋白）分泌非常重要。目前在EHEC O157:H7 中鉴定的效应蛋白与其它病原菌相比少了很多，而且已知效应蛋白的 作用也无法解释EHEC O157:H7 所导致的复杂的病理反应。 为深入探讨EHEC O157:H7 的致病机制，我们从所有病原菌基因数据库中提 取有关TTSS 序列数据，进行同源分析、模体分析以及基因定位分析，预测出2 个EHEC O157:H7 可能的新分子伴侣 （编码基因ecs4553，ecs4563 ），并对其三 级结构进行预测分析，结果表明其二级结构均以α 螺旋为主，符合TTSS 分子伴 侣的共同特征并进一步展开实验验证预测结果可靠性。 利用 PCR 方法从 EHEC O157:H7 基因组中扩增出新预测分子伴侣基因 ecs4553，并构建在表达载体 pET-28a(+) 、pET-24a(+)上，在 E.coli BL21(DE3) 中诱导表达，经SDS和Western blot 检测结果表明，成功实现了融合蛋 白 His -Ecs4553-His ，Ecs4553-His ，His -Ecs4553 的高效表达。His -Ecs4553 6 6 6 6 6 通过Ni2+亲和层析柱纯化；Ecs4553-His6 以包涵体形式表达，重组表达蛋白经纯 化，复性后获得了纯度为 93.5% 的目的蛋白；免疫新西兰大耳白兔制备了抗 Ecs4553-His6 的多克隆抗体，抗血清的ELISA 效价达1:409,600，产生的抗体具 有良好的免疫反应性，能够特异性识别基因工程表达的Ecs4553-His6 蛋白。 PCR 扩增了新预测分子伴侣基因ecs4563，并构建在表达载体pET-28a(+) 、 pET-24a(+) 上，重组载体转化至 E.coli BL21(DE3) 中 IPTG 诱导表达，经 SDS和 Western blot 检测结果表明，成功实现了融合蛋白 His -Ecs4563-His ，Ecs4563-His ，His -Ecs4563 的高效表达。His -Ecs4563 主要 6 6 6 6 6 以可溶形式表达，采用 Ni2+ 亲和层析纯化，获得纯度大于 90% 的目的蛋白； Ecs4563-His6 以可溶形式表达，通过Ni2+亲和层析纯化，并制备了多克隆抗体， Western blot 检测抗体具有良好的免疫反应性，Ecs4563-His6 的兔抗血清的免疫 I 大肠杆菌O157:H7 新分子伴侣的预测表达纯化及其相互作用蛋白的初步筛选 扩散效价为1:64 。 我们用 pull down 的方法从 EHEC O157:H7 全菌蛋白中筛选到了与 Ecs4563-His 及His -Ecs4563 相互作用的蛋白质，为ecs4200 基因编码的FKBP 6 6 型肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶（旋转异构酶）和 ecs4208 基因编码的 cAMP-调 控蛋白。 本研究克隆表达并纯化了新预测分子伴侣Ecs4553 ，Ecs4563 ，并初步筛选 到了Ecs4563 的相互作用蛋白，为下一步研究蛋白功能，阐明TTSS 的分泌机制， 进一步研究EHEC O157:H7 的致病机制奠定了基础。 关键词 肠出血性大肠杆菌O157:H7 ；I