大鼠局灶性脑挫伤后Cdk5表达变化.pdfVIP

·中文论著摘要· 大鼠局灶性脑挫伤后Cdk5表达变化 刖 昌 脑是重要的生命中枢器官，因遭受暴力导致的脑损伤非常常见，随着建筑业 和交通业的迅猛发展，创伤性脑损伤的发生率逐年升高，已严重威胁人们的生命 健康。脑挫伤在临床外伤中常见，也是在法医鉴定工作中遇到最多的损伤类型之 一，推断脑挫伤时间对于刑事案件的侦查及审判具有重要意义，因此关于脑损伤 的形成机制、时间推断及其程度判断应引起法医学工作者的重视。准确推断脑挫 伤时间一直是法医学中的难题，至今尚未圆满解决，因此有必要进一步研究脑挫 伤后的蛋白分子机理并找出相应的指标，为临床诊治和法医鉴定提供理论依据。 Cdk5是神经系统重要激酶之一，与其神经元特异性激活因子p35结合后，锚定于 细胞膜和细胞上，通过磷酸化包括微管相关蛋白、tau蛋白、神经丝蛋白、细胞骨 架蛋白、信号分子及调节蛋白的特异性丝氨酣苏氨酸位点，主要参与神经细胞的 细胞迁移、轴突导向、胞膜转运、维持微管稳定、细胞骨架调整、酶的修饰、调 节钙离子信号转导及神经递质释放【1埘。在病理条件下，如缺血、谷氨酸盐过量存 结合的Cdk5具有更强的激酶活性，定位也发生变化，此时Cdk5过度激活导致tau 蛋白、MAP．2等过度磷酸化【3‘41，破坏细胞骨架，从而导致细胞凋亡【51。Cdk5的 作用贯穿哺乳动物生命始终，含量稳定，其蛋白激酶作用活性仅仅局限于神经系 统，而p35是其神经元特异性蛋白。有研究发现，大鼠脑缺血再灌注损伤可引起 Cdk5的表达量增加，因此设想在大鼠脑中度钝力打击模型中Cdk5活性可能发生 变化，有必要利用脑损伤模型研究脑挫伤后Cdk5表达的时间规律性变化，为脑损 伤时『日J推断提供参考依据。 材料与方法 雄性SD大鼠50只，体重220．2509，由中国医科大学实验动物部提供。随机 分为lO组，其中包括8个实验组，1个正常对照组，1个假手术组，每组5只大 鼠。实验组采用吴旭等【6l研制的大鼠脑挫伤模型制作方法，制造大鼠局灶性闭合 性脑挫伤模型。乙醚吸入预麻醉，大鼠称重后，2％戊巴比妥钠(30mg／kg)腹腔 注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮，在人字缝前3mm，矢状缝旁3mm处钻直径 为5mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完好，采用自由落体打击装置，以309重锤从 25cm高处落下，打击暴露的脑组织；假手术组以相同的方法钻孔，但不进行打击。 术后动物分笼饲养，保持垫料清洁及空气通畅。分别于伤后3h、6h、12h、24h、 3d、3d、5d、lOci将大鼠乙醚麻醉后脱颈椎处死。手术取出脑组织，沿冠状方向 将挫伤区平均分为两部分，并对损伤周边区进行取材、修块，一份用于免疫组化 染色，另一份用于Westernblot检澳Ⅱ。对照组和假手术组以同样方法取相同部位的 脑组织作为对照。 脑组织经4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋， 制作511m厚度切片。采用链霉素．生物素法(SP法)进行免疫组化染色，并用苏 木素复染细胞核，具体步骤按照试剂盒说明书。Cdl【5多克隆一抗(1：400)稀释， 4C孵育过夜。染色过程中另以一抗稀释液替代一抗，作为阴性对照。兔来源 Cruz Cdk5(C-8)购自Santa 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 对用于Westernblot的脑组织进行裂解、匀浆、离心、提取蛋白并进行蛋白定 量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转印，5％脱脂牛奶封闭，一抗(1：400稀释)、 二抗(1：2000稀释)孵育后，DAB显色。实验中以D-aetin为内参。 实验结果 免疫组织化学染色结果：对照组及假手术组神经元胞浆中可见少量Cdk5蛋白 表达，阳性染色较淡。实验组中，脑挫伤后3h、6h组挫伤周边区可见阳性细胞数 逐渐增多，胞浆内Cdk5蛋白表达增多，阳性染色较深：6h、12h组阳性细胞数维 持在较高水平，伤后24h组阳性细胞数达到高峰，随后3d、5d组可见阳性细胞数 维持较高水平，7d、lOd组基本降至基础水平，并可见阳性细胞染色较淡。 Western blot结果：对照组和假手术组可见少量Cdk5表达；脑挫伤后3h、6h 峰，随后3d组、5d组维持在较高水平，7d、10d组降至基础水平。取损伤后不同 2 时间段条带的平均光密