PRL3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达.pdfVIP

北 京 大 学 学 报 （ 医 学 版 ） ·５１６· ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＥＫＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＨＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＣＥＳ）　Ｖｏｌ．４１　Ｎｏ．５　Ｏｃｔ．２００９ ·论著 · ＰＲＬ３基因 Ｃ１０４Ｓ位点突变体和 ＣＡＡＸ缺失体 的构建及表达 李伟军，邢晓芳，曲立科，孟　麟，寿成超△ （北京大学临床肿瘤学院，北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所生物化学与分子生物学研究室，恶性肿瘤发病机 制及转化研究教育部重点实验室，北京　１００１４２） ［摘　要］目的：分别构建肝再生磷酸酶３（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｌｉｖｅｒ３，ＰＲＬ３）基因Ｃ１０４Ｓ位点突变和Ｃ端 ＣＡＡＸ缺失的ｍｙｃ标签和 ＧＦＰ荧光标签重组质粒 ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＰＲＬ３（Ｃ１０４Ｓ）、ｐＥＧＦＰＰＲＬ３（Ｃ１０４Ｓ）、ｐｃＤＮＡ３ ｍｙｃＰＲＬ３（ ＣＡＡＸ）和ｐＥＧＦＰＰＲＬ３（ ＣＡＡＸ），并进行真核表达，为ＰＲＬ３的后续功能研究提供有效的工具。 △ △ 方法：设计ＰＲＬ３基因Ｃ１０４Ｓ点突变、Ｃ端ＣＡＡＸ缺失的特异性引物，以ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＰＲＬ３质粒为模板，通过基因 克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒，通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞，检测其在细胞中的表达并观察 定位情况。结果：成功构建了４种重组质粒，并能在结肠癌细胞ＬｏＶｏ中表达。用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中 绿色荧光融合蛋白的定位观察发现，当ＰＲＬ３的ＣＡＡＸ位点缺失后，ＰＲＬ３由内膜系统大量入核，与理论预期相符。 结论：获得了ＰＲＬ３基因Ｃ１０４Ｓ位点突变体和ＣＡＡＸ缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达，为进一步研究 ＰＲＬ３的功能提供了条件。 ［关键词］蛋白质酪氨酸磷酸酶；肿瘤；点突变；基因缺失 ［中图分类号］Ｒ７３３７　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１６７１１６７Ｘ（２００９）０５０５１６０５ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１１６７Ｘ．２００９．０５．００２ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＲＬ３ｐｌａｓｍｉｄｗｉｔｈＣ１０４ＳｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄＣＡＡＸ ｄｅｌｅｔｉｏｎ △ ＬＩＷｅｉｊｕｎ，ＸＩＮＧＸｉａｏｆａｎｇ，ＱＵＬｉｋｅ，ＭＥＮＧＬｉｎ，ＳＨＯＵＣｈｅｎｇｃｈａｏ （ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１４２，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＰＲＬ３ｇｅｎｅＣ１０４ＳｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄＣＡＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓ： ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＰＲＬ３（Ｃ１０４Ｓ），ｐＥＧＦＰＰＲＬ３（Ｃ１０４Ｓ），ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＰＲＬ３（ ＣＡＡＸ）ａｎｄ △ ｐＥＧＦＰＰＲＬ３（ ＣＡＡＸ），ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｓｅｐｌａｓｍｉｄｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ △ ｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｍｕｔａｔｅｄｗｉｔｈｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＰＲＬ３ｐｌａｓｍｉｄａｓｔｅｍｐｌａｔｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ．Ｍｕｔａｎｔｓｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｎｔｈｅｓｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＬｏＶｏｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｓｉｏｎ