托吡酯在肌萎缩侧索硬化的器官型脊髓培养模型中对运动神经元的保护.pdfVIP

中文 摘 要 托毗醋在肌萎缩侧索硬化的器官型脊髓培养模型中 对运动神经元的保护 摘 要 目的:肌萎缩侧索硬化 (ALS)是一种选择性累及上、 下运动神经元的进行性神经系统变性疾病。临床表现为肌无 力、肌萎缩，多在首次出现症状后的3-5年内，最终由于呼吸 衰竭死亡。目前关于该病的病因和发病机制还不明确，曾提 出多种假说，包括兴奋毒作用、自身免疫异常、氧化应激、 神经元调亡及线粒体功能障碍等。越来越多的证据表明谷氨 酸介导的兴奋毒性作用是ALS发病的重要环节。谷氨酸是中 枢神经系统内重要的兴奋性神经递质，谷氨酸能神经元过度 激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积均可通过激活谷氨酸 受体对突触后神经元及其周围组织造成兴奋毒性。脊髓的器 官型培养可以长时间地进行培养并可维持相对完整的脊髓 形态，较单细胞培养更适于研究脊髓病变。我们利用脊髓器 官型培养技术，结合谷氨酸兴奋毒机制，慢性阻抑培养脊髓 片的谷氨酸转运，可以制备ALS的体外培养模型。托毗酚是 一种新型的抗癫痈药物，它的结构与其他的抗癫痈药物不 同。一系列研究显示，托毗醋可以抑制海仁藻酸而不是N- 甲基一D一门冬氨酸诱导的癫痈，并且在对离子通道活性的研 究中表明，托毗酷能够影响AMPAIKA受体的激活，根据它的 这些药理学特性，我们想验证一下托毗醋在长时间谷氨酸介 导的兴奋性毒性作用的器官型培养模型中对运动神经元是 否具有保护作用。 中 文 摘 要 方法:1.器官型脊髓薄片培养模型的建立 采用8日龄 SD大鼠的腰段脊髓，在无菌条件下快速分离、取出整条脊髓， 解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根，用MCIL组织切 片机切成350pm厚的薄片，将腰段脊髓的切片转移到无菌的 GBSS中 (含葡萄糖6.4mg/ml)，在室温下仔细分离成单片，6 孔培养板内每孔放入lml培养基MS，并放置Millipore insert.，将完好的脊髓片小心地转移至insert上，每个 insert上放5片，将培养板放入C02培养箱(370C，5%C02+95% 空气)，每周换液2次。 2.将实验分为四组 (1)正常对照组:每孔加入正常培养液lml (2)THA组:每孔加入THA100umol/Llml (3)THA+托毗醋组A:每孔加THA100umol//L+托毗酷10 pmol/Llml (4)THA+托毗酩组B:每孔加THA100“mol/L+托毗醋 100 umol/Llml 第((2)(3)(4)组在培养的第一周加正常的培养液，在一周后 分别加入各自分组中的培养液。 3.免疫组化染色 培养四周后将组织取出，用4%的多 聚甲醛固定。a运动神经元的存活通过培养物的形态和非磷 酸化神经丝重链 (SM工一32)免疫组化染色加以鉴定。在低倍 光学显微镜下对每一个脊髓片进行运动神经元计数，结果用 均数士标准差来表示。用t检验分析正常对照组与THA组、托 毗酷组与THA组脊髓腹角运动神经元个数。检验水准。 =0.050 结果:1.正常对照组、THA100加托毗醋组A,THA100加 中文 摘 要 托毗酷组B均可见脊髓片在体外生长良好，体积增大，组织 边缘有光晕，培养存活率高，达90%以上。THA100组的脊 髓片脊髓腹角明显变薄，颜色逐渐变暗，而背角变化不明显。 2.正常对照组、THA100加托毗酩组A,THA100加托毗醋 组B脊髓片每片的两侧腹角均有许多a运动神经元被染成深 棕色，其直径均在25lim以上，突起细长，彼此形成突触联 系。THA100组的。运动神经元数目稀少，突起短而且细，细 胞之间不能形成突触联系。 结论:在脊髓片器官型培养体系中加入谷氨酸转运体抑 制剂苏一轻天冬氨酸 (THA)，可以引起培养液中谷氨酸浓度 的持续增加，使运动神经元在几周之内出现损伤，而脊髓背 角的中间神经元无明显改变，建立了稳定的ALS体外器官型 培养模型，为进一步探讨ALS的发病机制和神经保护剂的筛 选提供手段。托毗酷是一种新型的抗癫痈药物，因为它可以 拮抗Kainate/AMPA受体，有阻断非NMDA受体的作用。我们