滚环扩增型压电石英晶体传感器检测乙型肝炎病毒.pdfVIP

Vo1．35 高等 学校 化 学 学报 No．8 2014年 8月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 1635～1639 doi：10．7503／cjc 滚环扩增型压 电石英晶体传感器 检测乙型肝炎病毒 姚眷艳，王云霞，府伟灵 (第三军医大学西南医院检验科，重庆400038) 摘要 通过捕获探针与纳米金膜之间的共价连接，保证了滚环扩增(RCA)产物始终结合于金膜表面，Phi29 DNA聚合酶的高效扩增和EschenchiacoliDNA链接酶的高度精确性使检测达到单碱基识别，检测灵敏度达 到10copies／mL．实验结果表明，与单碱基错配序列相比，RCA可明显增强检测的灵敏度．该 RCA基因传 感器操作简单，灵敏度和特异性较高，在乙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力． 关键词 滚环扩增；石英晶体传感器；乙型肝炎病毒 中图分类号 0657 文献标志码 A 压电生物传感器是利用石英晶体对质量变化的敏感性，结合生物学识别反应而形成的一种 自动化 分析检测系统，其灵敏度取决于石英晶体的响应频率，该传感器具有灵敏度高、特异性好、响应快及 小巧简便等特点¨l2j．其中压电石英晶体传感器可对多种待测物进行实时、快速、连续的定量测定及反 应动力学研究，克服了传统免疫检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐等缺点，具有广泛的发展前景 和临床使用价值 ．用压电石英晶体传感器检测核酸分子时，为了达到液相中核酸分子的检测灵敏 度，多采用聚合酶链式反应 (PCR)或rI7多聚酶对靶分子进行预扩增，这些扩增步骤既增加了检测成 本 ，也容易造成非特异性扩增．近年来，分子生物学技术的进展为核酸扩增提供了多种可能，其中滚 环扩增技术 (RCA)是一种无需温度循环和产物分离的新型扩增技术 ，加．在RCA过程中引物结合到 环状模板上，在DNA聚合酶的作用下不断延伸，可产生与环状模板互补的大量重复序列线状单链产 物 ”．目前，RCA技术已应用于DNA、RNA、蛋 白及单碱基多态性 (SNP)的检测．RCA技术的优点 在于无需扩增仪，同时其单链扩增特性使扩增产物的一端可始终连接于固相载体，非常适合于固相形 式的传感器信号检测．俞汝勤等 将RCA技术与电化学方法结合进行了蛋白质的系列检测研究． 肝炎是世界性的公共健康问题，在亚洲国家乙型肝炎病毒(HBV)是肝脏疾病的主要诱因，与肝癌 及肝硬化密切相关．中国的乙型肝炎病毒感染呈高发趋势，有1．2亿人携带乙型肝炎病毒u51J．目前， 在临床上应用的乙型肝炎病毒检测手段包括化学发光法、等位杂交技术、巢式PCR(Nested-PCR)、反 转录PCR(RT-PCR)及基因传感器 ¨’，擂等．PCR扩增技术是最常用的临床诊断技术，但该方法操作繁 琐，且需要高精度的仪器设备，因此开发一种简便、特异且高灵敏度的检测方法尤为重要．本文将 RCA技术与压电生物传感器相结合，建立了一种新型高灵敏度的乙型肝炎病毒检测方法，将 RCA的 高扩增特性与压电生物传感器的高灵敏性相结合，实现了乙肝病毒核酸分子的高灵敏度检测． 1 实验部分 1．1 试剂及 ItBVDNA的提取 实验所用序列均购 自大连Takara生物技术公司(序列见表 1)，其中捕获探针的5端经巯基修饰后 固定于金膜表面；Phi29DNA聚合酶、EscherichiacollDNA扩增酶及 dNTPs均购 自Takara生物技术公 收稿 日期：2014-06-06． 基金项 目：国家 自然科学基金 (批准号81371885)资助． 联系人简介：府伟灵 ，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物传感器与分子生物学研究．E—mail：weilingfu@yahoo．corn 1636 高等 学校 化 学 学报 V01．35 司；其余试剂均为分析纯．固定