5第五章基因载体的选择与构建.pptVIP

1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选 1）用限制性酶消化 DNA 样品 粘性末端 3）连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 冷循环器 4）用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。 5）细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选 筛选会有三种结果： 一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成； 二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落； 三是要插入的序列与质粒相连，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。 倒平板 加IPTG和X-GAL 乳糖和诱导物IPTG的化学结构 X-gal X-gal水解 筛选结果 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码的功能性的 α 片段 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片段 筛选结果模式图 蓝菌落 蓝白菌落 isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 筛选白色菌落 二、噬菌体载体与黏粒载体 一）噬菌体载体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 噬菌体 (电镜图） 　1、λ-DNA的物理图谱 λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。 特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。 cos位点的作用 2、感染周期 噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入 ： （1）吸附 （2）DNA注入 （3）DNA复制 （4）包装: 只能包装λ-DNA分子的75%-105% 即包装范围为36.4kb-50.9kb的DNA （5）裂解 吸附 穿入 生物合成 成熟、释放 毒性噬菌体的溶菌性周期 * * 第五章 基因载体的选择与构建 一、载体的功能、特征及质粒载体 二、噬菌体载体与黏粒载体 一、载体的功能、特征及质粒载体 克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。 目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。 一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二）载体应具备的特征条件 1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 三）质 粒 （plasmid） 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。 ★不是细菌生长所必需的 ★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★分子量在1-200kb之间 1、质粒的基本特性 （1）自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 （2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存 （3）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制 严谨型复制 （4）可转移性 在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。 2、质粒的构建 　（1） 天然存在的两种质粒 A、colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell B、pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell （2） 质粒人工构建的目的 天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体