cDNA-AFLP技术及其在干果研究中的应用.pdfVIP

eDNA．AFLP技术及其在干果研究中的应用 155 cDNA-AFLP技术及其在干果研究中的应用 薛渝峰1 赵锦2 刘孟军1 (1河北农业大学中国枣研究中心，保定071001；2河北农业大学生命科学学院，保定071001) 差异显示技术，具有重复性高、准确、高效性且不需预先知道序列信息的优点，已广泛应用于植 物基因特异性表达研究、植物遗传标记分析及分离特异基因等方面。本文阐 了该技术的原理及 其应用技术领域，并对其在干果研究中的应用情况介绍。 关键词：cDNA．AFLP；基因表达；干果 植物在整个生命活动中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及 细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。因此，通过比较同一 类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提 供重要信息。真核生物基因组庞大，但在生物体内任意细胞中只有15％的基因得以表达，这 些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行的，这种表达的方式即为基因的差异表达，包 括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。基因差异表达的变化是调控细胞生命活动 过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达 差异、分离差异表达基因，可为分析植物生命活动过程提供重要信息，揭示植物生命活动的 规律，为生物改良奠定基础。 植物基因分离及其表达调控研究，可以从蛋白质水平、mRNA水平和基因组DNA水平 上进行。如果对基因表达的直接产物不清楚，从蛋白质水平分离目的基因会有一定难度；在 基因组DNA水平上，分子标记的遗传距离如果大于lcm，用图位克隆目的基因也很难；而 在mRNA水平上，在对目的基因序列一无所知的情况下，也可直观地分析基因表达差异并分 离目的基因，mRNA分离差异技术已广泛用于分离真核生物不同细胞、不同器官以及不同环 境条件下的差异表达基因，探索基因表达调控机制，从分子水平上揭示其机理。 近年来，分离差异表达基因的技术不断发展完善，出现了mRNA差异显示技术 (DDRl’-P 等，目前这些方法已得到广泛应用，并已成功分离了许多差异表达的基因。但cDNA扩增片 diffcrentmRNA mRNA差异显示技【lJ(mRNA DD)。但该技术仍存在“假阳性”高、 display 实验室重复性差、3’端引物倒数第二个碱基的简并性，使得某些差异条纹不能被扩增等缺点【2】。 纹图谱技术，该技术保留了AFLP技术的可靠性与高效性，且不需要预先知道序列信息，所需 仪器设备简单，可广泛地应用于植物生长发育过程基因分离与表达特性的研究【3】。同年Money 156 干果研究进展(5) ／f．斤TPCR循环数目和转录本稀释浓度对反应的影响，检测了扩增中M92+浓度的影响作用‘51。 的应用情况，并对该技术在干果研究上的应用前景进行了阐述。 ． 1 cDNA—AFLP技术原理 片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通 cDNA片段的酶切和人工接头的连接；(3)酶切片段的预扩增和选择性扩增；(4)凝胶电泳分析。 预扩增过程为选择性扩增提供了大量充足的模板，而且所用的原始材料量极少，每份样品 足实验的需要。cDNA．AFLP扩增的片段大小在100～1 000bp之间，平均每对引物约扩增50条 谱带。因此，利用对合适的内切酶组合和256对引物即可得到大约13000条带。 2cDNA—AFLP技术特点 2．1 cDNA—AFLP指纹技术重复·|生高，“假阳性”低，可以检测低丰度表达的mRNA I选择引物 扩增所产生的条带，结果是不同批次选择扩增的结果完全一致，验证了该技术具有很好的重 7|。 ． 的特异性和重复性高于95％t 2．2