Δ-%276-脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达及表达条件的探索.pdf

南肝人学坝Hdf宄生毕业(学位)论义 中史摘要 中文摘要 a(：i Y亚麻酸(Y～linolenicd，GLA)作为人体的一种必需脂肪酸，是具 有重要生理活性物质的前列腺素PG—I和PG—lI的前体，它在人体内由△o．脂肪酸脱 acid 氢酶(△b．fatty 阳性菌、阴性菌，抗ItlV感染，抗肿瘤，抗多种炎症和抗粥性硬化等作用，具有 很高的药用价值。然而传统来源的GLA由于受许多自然条件的限制，资源有限不 能满足市场需求，开发新的GLA来源已备受关注。 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来应用较多的种外源基因表达 系统，其中含有底物亚油酸以及丰富的油酸(亚油酸的底物)，是生产GLA很有 潜力的表达系统。 为了在毕赤酵母中建立一种新的合成Y一亚麻酸的表达体系，本研究将高山被 5K连接，Sacl 孢霉和少根根霉△6一脂肪酸脱氢酶基因与毕赤胞内表达载体pPIC3 线性化后电击法转化毕赤酵母GSll5，获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合 到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达，通过脂肪酸气相色谱和气相色谱一质谱 (GC—MS)联用分析表明△6一脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达，Y．可E麻 酸含量分别占总脂肪酸的17．02％和62％。与此同时，转基因酵母细胞中还检测到 C16：2△6,9 了C16：2△6,9 脂肪酸脱氢酶在毕赤酵母中的催化功能没有链长特异性，而只有键位特异性。但 从脂肪酸的合成量来说，矿脂肪酸脱氢酶偏好于亚油酸。 对少根根霉△6脂肪酸脱氢酶基因转译起始密码子进行改造，提高了基因在毕 赤酵母巾的表达量。Y一亚麻酸含量从原来的6．2％提高到10．4％。以高山被孢霉△ 。脂肪酸脱氢酶基因为代表进行转基因毕赤酵母最佳表达条件的探索。将不同宿主 的转基因毕赤酵母分别在不同甲醇浓度、不同诱导温度、不同诱导时间、不同通 气量、甲醇一甘油混合诱导等条件下培养。结果表明在以毕赤酵母GSll5为表达宿 主，终浓度0．5％的甲醇为诱导物，诱导温度20。C，诱导时间72小时，高通气量的 条件下，驴脂肪酸脱氢酶的活性最高，Y一亚麻酸在总脂肪酸中含量达到17．07％。 本研究是国内外首次将△6脂肪酸脱氢酶基因转化入毕赤酵母表达系统进行 研究的报道。 关键词：A6胡目肪酸脱氢酶，毕赤酵母，基因表达，转译起始密码子，Y．亚麻 酸，高山被孢霉，少根根霉 塑翌尘兰塑!塑塾兰兰些!堂些!堡兰———— 墨兰塑茎 ABSTRACT Y—linolenic 18：3A essential acid(GLA，C6，912)，an acid， polyunsaturatedfatty an roleinhormone and acidmetabolization．A playsimportant regulationfatty o—fatty acid the ofthedesaturationoflinoleicacid desaturase(D6D)is enzyme rate—limiting the ofY—linolenicacidA ofGLA have (C18：2△’’“1in production deficiencymay A occurredwhen acid decrea