高效液相色谱的分析.docVIP

第三章 高效液相色谱分析 基本要点：1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围；2. 了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程；3. 理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；4. 理解各种分离方式的原理及选择原则。 第一节 高效液相色谱法的特点 一、概述?????? ??? 液相色谱法是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。? 70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9?107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 二、特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。???? 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 ???? 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 ???? 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 ???? 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素 ??? 1. 涡流扩散项He A = 2λdp 其含义与其相色谱法相同。 ?? ??2．纵向扩散项Hd Hd=CdDm/u????? ??( 注：对GC:? ?B/u = 2γDg/u) 式中Cd为常数。由于分子在液相中扩散系数比气相中要小得多，一般小4~5个数量级。故在液相色谱中，此项可以忽略不计。 ???? 3．传质阻力项 ???? 可分为固定相传质阻力项Hs和流动相传质阻力项。 a. 固定相传质阻力项Hs Hs=CsDf2u/Ds 式中：Cs为与k有关的常数，Df固定液的液膜厚度，Ds试样分子在固定液中的扩散系数。它与气相色谱法中传质阻力项的含义相同。 ???? b. 流动相传质阻力项： ??? ?i.流动的流动相传质阻力项Hm： ???? 当试样分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的分子流速较慢一些，中央的分子流速较快一些，从而引起色谱峰型扩张。 Hm=Cmdp2u/Dm 式中：Cm为与k有关的函数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。 ?? ??ii. 流动相传质阻力项Hsm： 由于固定相是多孔的，部分流动相分子可能进入固定相的微孔中而滞留固定相中的某一局部，滞留在固定相微孔中这部分流动相一般是停滞不流动的。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须先自流动相扩散到滞留区。因此，固定相的颗粒体积越大，微孔越深，传质速度越慢，峰型扩张越严重。 Hs=Csmdpu/Dm 式中：Csm为一常数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。要降低Hsm，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。 ?? 综上所述，柱内各种因素引起的塔板高度H为： H= 2λdp+ CdDm/u +( CsDf2/Ds + Cmdp2/Dm + Csmdp/Dm) 可简写为：????????????? H=A+B/u+Cu 上式与气相色谱的速率方程在形式上是一致的，其主要区别在于纵向扩散相可以忽略不计。 ??? 提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。 二、影响分离的因素——流速 ? ??由图3-1知，液相色谱H-u曲线与其气相色谱不同，是一段斜率不大的直线，只是因为分子扩散相对H值的影响可以忽略