高效液相色谱仪使用.ppt

高效液相色谱仪(HPLC)的使用 主要内容 一、概述 二、类型 三、分离原理 四、仪器组成（重点） 五、仪器分析过程与操作 一、概述 色谱的发展 色谱的类型 1.HPLC与经典LC HPLC比起经典LC的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力加料，流出速度极慢，流动相速度为30ml·h-1，需用20h才能分离出20种氨基酸；而HPLC配备了高压输液设备，流速最高可达 10ml·min-1，只需l h之内即可完成氨基酸的分离。 高效：固定相具有分离效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。 高灵敏度：高灵敏度检测器，可检测μM级甚至nM级别的待测物。 高自动化：操作自动化，可仪器控制流动相比例、流速、波长、出峰时间、进样及自动生成分析报告等。 2. HPLC与GC （l）气相色谱法(GC)分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。 （2)GC中流动相是惰性气体，它与组分没有亲和力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用。 （3）GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC可在室温条件下工作。 HPLC应用 （1）生命化学：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、酶、维生素等物质的分离和测定； （2）化学与精细化工：植物色素、高聚物、染料、化工产品、合成化合物等的分离和分析；无机离子的测定等； （3）农业、食品与医药学：添加剂（甜味剂、防腐剂、着色剂）、营养成分（蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸等）、药物体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物、农药残留等； （4）环境分析与毒理学：多环芳烃及农药残留、DNA加合物分析。 优点是灵敏度高，分离效果好；缺点是仪器设备费用昂贵，需摸索分析方法，操作严格，这是它的主要缺点。 二、液液色谱法的分类 液液色谱法按固定相和流动相的 极性不同可分为： 正相色谱法 反相色谱法 正相色谱法　固定相极性大于流动相。 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。 反相色谱法　固定相极性小于流动相。一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。它在液相色谱中应用最为广泛，占整个HPLC应用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 三、色谱法的分离原理 分离原理 样本组分进样到色谱柱上时，会与固定相发生作用，包括吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用。当流动相洗脱色谱柱时，由于各组分与固定相作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，和固定相结合弱的组分先出来，结合强的后出来，不同组分会先后从固定相中流出，一个物质会形成一个色谱峰。 色谱法由于能分离许多物质，被称为分离的巨人。 基本术语 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线。 基线(base line)——在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线。不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰。前者少见，可能是柱子出问题。 保留时间(retention time，tR)——组分从进样到出现峰最大值所需的时间。 理论塔板数(theoretical plate number，N) ——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 当色谱柱长度一定时，塔板数 N越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能越高，所得色谱峰越窄。 峰高(peak height，h)—峰的最高点至峰底的距离。 峰面积(