脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞移植对神经功能和促血管生成素-1.docVIP

神经科论文神经内科医学论文神经内科论文： 脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞移植对神经功能和促血管生成素-1、2及其受体表达的影响 【摘 要】 目的探讨脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对神经功能和促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)表达的影响。方法42只SD大鼠随机分为脑缺血对照组(对照组，12只)、BMSC移植组(15只)及假手术组(15只)，各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组。用线栓法制作脑缺血大鼠模型，用改良黏附物移除试验(MST)评估大鼠神经功能。在脑缺血后21 d，给BMSCs移植组大鼠尾静脉注射BMSCs，对照组大鼠注射等体积PBS。在脑缺血后28 d、35 d、42 d(移植后7 d、14 d、21 d)，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blotting法检测大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的水平。结果BMSCs移植组大鼠各时间点亚组的MST评分均显著高于对照组(均P＜0.05);BM-SCs移植组及对照组各时间点亚组脑组织的Ang-1、Tie-2 mRNA和蛋白水平明显高于假手术组(P＜0．05～0.01)，脑缺血后28 d、35 d，BMSCs移植组脑组织Ang-1、Tie-2 mRNA及蛋白水平均明显高于对照组(均P＜0.01)，而脑缺血后42 d两组之间的差异无统计学意义;3组各时间点亚组脑组织Ang-2 mRNA及蛋白水平的差异均无统计学意义。结论脑缺血恢复期BMSCs移植能改善神经功能，并使缺血周围脑组织Ang-1、Tie-2的表达水平明显增高，而对Ang-2表达无明显影响。 【关键词】 骨髓间充质干细胞;脑缺血;促血管生成素-1;促血管生成素-2;酪氨酸激酶受体-2 促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)是介导脑缺血后血管源性水肿、血管生成和血管成熟稳定的关键因子。有研究［1］报道，在脑缺血急性期移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)能使缺血周围脑组织的Ang-1、Tie-2表达上调，减少血-脑屏障的破坏而减轻血管源性脑水肿。由于条件限制及其他原因使大多数患者难以在脑梗死急性期得到BMSCs移植治疗;有关脑梗死恢复期BMSCs移植治疗的报道很少。为探讨脑梗死恢复期BMSCs移植治疗的效果及其机制，本研究在大鼠脑缺血恢复期进行BMSCs移植治疗，观察其对神经功能和脑缺血周围组织Ang-1、Ang-2和Tie-2表达的影响。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠42只，质量250～280 g，由南京医科大学实验动物中心提供并于该中心屏障系统实验室饲养，自由喂食。动物分为脑缺血对照组(对照组，12只)、BMSC移植组(15只)、假手术组(15只)，各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组。 1．1．2试剂与仪器 低糖DMEM培养基(L-DMEM)、胎牛血清、0．25%胰蛋白酶(GIBCO公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RT试剂盒、Taq聚合酶、DNAMarker(Takara公司)，兔抗大鼠Ang-1、Ang-2 IgG多克隆抗体(博奥森公司)，兔抗大鼠Tie-2 IgG多克隆抗体(Santacrus公司)，兔抗大鼠β-actin IgG单克隆抗体(博士德公司);二氧化碳恒温培养箱(Heraeus公司)，倒置显微镜(OLYMPUS公司)，分光光度计(Amersham Bioscience公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。 1．2方法 1．2．1大鼠脑缺血模型制作 大鼠术前禁食6 h，参照Longa等［2］线栓法制作右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)脑缺血模型，缺血90 min后，拔除线栓，术中和术后使动物肛温保持在37℃。假手术组大鼠除不插入线栓外其他操作相同。在大鼠缺血24 h时进行Longa 5级4分法评分，取1～3分大鼠入组。 1．2．2 BMSC的分离培养及移植将1只6周龄雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取股骨，参照Zacharek等［1］方法进行BMSCs的原代培养及传代，取4～6代的细胞用于移植。BMSC移植组大鼠在脑缺血21 d后，通过尾静脉注射1 ml BMSCs悬液(约含2×106个BMSCs)，对照组大鼠同时尾静脉注入1 ml PBS，假手术组不进行注射。 1．2．3神经功能评定各组大鼠在脑缺血后第21 d、24 d、28 d、35 d和42 d用改良黏附物移除试验(MST)［3］评定神经功能。用一条医用胶带缠绕在大鼠的左前爪(无力侧)，形成一个袖套样胶圈，将大鼠移到笼中观察30 s，记