普那霉素产生菌原生质体诱变育种的研究.docVIP

普那霉素产生菌的原生质体诱变育种 摘要： 普那霉素产生菌始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)11-2在含0．5％甘氨酸的种子培养基中培养到对数生长期，收集菌丝体,经2mg／ml溶菌酶在30℃下作用90min可获得大量的原生质体，其再生率为5．1％。始旋链霉菌11-2原生质体经UV诱变并在含普那霉素的再生平板上筛选普那霉素抗性菌株，从中获得一高产突变株始旋链霉菌ZP-07，普那霉素产量达到1.59g／L，比出发菌株提高101．3％。 关键词： 普那霉素； 原生质体； 诱变； 筛选 Selection of high pristinamycin-producing strain through mutation of protoplast induced by UV radiation ABSTRACT To select a high pristinamycin·-producing strain through protoplast mutation induced by UV radiation，factors affecting protoplast formation and regeneration were studied．Streptornyces pristinaespiralis 11-2 was cultured in a breeding medium containing 0.5％ glycine until expnential phase of growth；the mycelia were processed with 2mg／ml lysozyme at 30 for 90 minutes；the protoplasts were obtained and the regeneration frequency was 51％ the protoplasts of　Ｓ．pristinaespiralis were induced by UV radiation；the mutants were screened on the regenerative plate containing 20mg／L pristinamycin；and a pristinamycin—resistant mutant，S．pristinaespiralis ZP07， was obtainedwhose pristinamycin output reached 1.59g／L increased by 11.3％ compared with the starting strain． KEYWORDS Pristinamycin； Protoplast； Mutagenesis； Screening (pristinamycins)属链阳性菌素类抗生素，由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生，由约30％的普那霉素I和约70％ 的普那霉素Ⅱ组成，两者具有协同作用。普那霉素对革兰阳性菌有较强的杀菌活性，主要用于治疗由革兰阳性菌包括耐药菌引起的感染[1]。经过化学修饰得到的水溶性衍生物喹奴普丁／达福普汀对耐药性革兰阳性菌具有很强的杀菌作用，且有较长的抗生素后效应和不易产生耐药性等优点，是目前治疗由耐药的革兰阳性菌引起的感染最有效的抗生素之一[2]。 本文研究普那霉素产生菌始旋链霉菌的原生质体制备与再生条件，并进行诱变育种，以期获得高产菌株。 1 材料和方法 1．1 出发菌株 始旋链霉菌(S．pristinaespiralis)11-2 1．2 培养基、溶液和试剂 斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均参照文献[3]，再生培养基为R2YE培养基[4]，PB液、微量元素、TES缓冲液等参照文献[4]。 1．3 培养条件 斜面培养条件、种瓶培养条件、发酵培养条件均参照文献[3]。 1．4 菌种处理 1．4．1 菌体生长曲线制备　在种子培养基中接入菌株始旋链霉菌11-2，按种瓶培养条件培养80h，每隔一定时间取10mL种子液，离心、烘干测定菌体干重，绘制该产生菌的生长曲线。 1．4．2 原生质体及单孢子悬液的制备 (1)原生质体制备 始旋链霉菌11-2新鲜斜面培养物在含一定浓度甘氨酸的种子培养基中培养一段时间后，收集对数生长期的菌丝，经玻璃珠打碎、PB液洗涤，用溶菌酶溶液于一定温度的水浴中酶解一定时间，每隔10min振荡一次，再用四层纱布过滤酶解液，滤液2000r／min离心5min，收集原生质体悬浮于PB液中，备用。 (2)单孢子悬液制备 刮取成熟斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬浮液，再将其装入内有已灭菌玻璃珠的摇瓶内振