酵母杂交技术原理及应用研究20442.ppt

酵母双杂交系统的建立 酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明， 转录激活因子在结构上是组件式的， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成， 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain， 简称为BD)和转录激活结构域(activation domain， 简称为AD)，　 BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游 ；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的BD虽然能和启动子结合， 但是不能激活转录。 不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能 （如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42　融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录） 　　酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。 　　 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株　具有许多优点: 　　　〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 　　　〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 　　　〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如 GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 原理 噬菌体展示技术是将外源DNA 通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来。 该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。 * 目的基因的分离 目的基因的功能克隆 序列克隆法 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术 利用差示分析法分离目的基因克隆 DNA插入诱变法分离目的基因 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆 目的基因的功能克隆 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白 应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列， 推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作为探针 从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因 将分离纯化的特定编码蛋白作为抗原，利用免疫动物制备抗体 用特异的蛋白质抗体筛选含有目的基因插入序列的cDNA表达文库，分离出含有目的基因的克隆。 在平板上涂布文库和制备硝酸纤维滤膜的拷贝 然后将滤膜处理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白， 在将滤膜放入含有抗体的溶液中，温育一定时间后，洗去未结合的抗体，在加入第二抗体或葡萄球菌蛋白A。第二抗体是用放射性同位素或生物素或酶标记的，通过该标记找到表达产物能与抗体结合的克隆，从而筛选出目的cDNA克隆。 返 回 　　自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。已知组蛋白在因、肌动蛋白基因及β-神经生长因子（β-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探针，并已成功地用于分离相关的基因。　　在同一蛋白质家族内，也存在着具有共同氨基酸序列的区段，即所谓的保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的长度显然适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。 序列克隆法 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 表达序列标签法分离目的基因ESTs 基因表达序列分析法 返 回 利用差示分析法分离目的基因克隆 mRNA差别显示技术 mRNA差别显示技术 抑制性减法杂交技术 返 回 酵母双杂交 　　　如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 1）将