2015年PCR技术以及常见问题解析.pptVIP

PCR技术应用及常见问题解析 南京凯基生物科技发展有限公司 目录 基因表达研究的背景 传统PCR技术（链式聚合酶反应） PCR反应体系以及反应程序 PCR常见问题分析 实时定量PCR（Real-time PCR） 实时定量PCR的原理 实时定量PCR采用的方法 实时定量PCR常见问题解析 基因表达的研究背景 基因表达研究策略 二、实验材料、仪器和试剂 1. 材料：人肾小管上皮细胞等样本组织 2. 仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备、DEPC水等 3. 试剂：Trizol试剂（凯基试剂盒） RT-PCR试剂盒（凯基试剂盒） 3. RT Reaction 4. PCR Reaction 实时荧光定量PCR Real Time PCR and Conventional PCR 荧光定量PCR和常规PCR技术的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）； 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值。 DNA binding dyes 非特异性的嵌入荧光染料评价 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况。 Taqman 技术 PE公司开发 原理： 设计一个能与PCR产物杂交的荧光标记的基因探针，其 5’ 端标记报告基团（Reporter, R）， 3’ 端标记荧光抑制基团（Quencher, Q）, 在一定距离范围内，Q 基团可吸收R 基团发出的荧光，因此，只有探针被切断后，R 基团的荧光信号才能被检测到。 探针定量原理 荧光实时定量PCR技术最新进展 多重实时定量PCR技术的发展 荧光实时RT－PCR技术的发展 多重实时荧光定量PCR 双链DNA特异染料（SYBR）不能在一个反应管中检测多个目的产物 荧光染料LUX（Light Upon Extension）标记的引物可以进行多元化的扩增。这些荧光基团有不同的荧光发射波长，从而可以区分不同引物介导的扩增产物。 qRT-PCR实例 一、实验目的 实时定量PCR来测定样品中特定核苷酸的实时扩增产物。 二、材料 实时定量PCR试剂：1. ABI taqman PCR核心试剂盒 2. ABI SYBR PCR核心试剂盒 三、方法步骤 1. SYBR绿色试剂盒的实时PCR PCR实验建议 防止RNA酶污染问题的措施（玻璃仪器，塑料仪器，实验人员） RNA的保存，Mixer的分装，酶制剂的保存与分装，dNTP的分装等 实验之前试剂的混匀，移液枪的量程最大化 PCR过程中试剂的添加顺序：水－X－X－酶等，大量混合分装。 对照实验的建立，阳性对照，阴性对照，重复性实验。 PCR引物的设计问题 guoqiang_ying@ ——凯基生物技术发展有限公司 ? ? ? ? ? ? Gel bands ? ? ? MeltCurves ? ? Gel bands First Amplification cycle--Starting Quantities. Data dsDNA varies--different sizes. ? ? dsDNA 65-150 bp Amplicon ? 4.Cycle 20-30. ? 4.Cycle 40. ? 3.Extension 72oC 1-3 min. 3.Extension 72oC 1-3 min. or dont need. ? 2.Annealing 60oC 1 min. ? 2.Annealing 60oC 1 min. ? 1.Denature 95oC 1min. ? 1.Denature