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2006年 10月 四川大学学报(自然科学版) oct.2006 第43卷第5期 JournalofsichuanUnivers ity(NaturalscienceEdition) Vol.43 N0.5 文章编号:0490一6756(2006)05一1101一04 DebaryomycessP.甘油激酶基本动力学性质研究 谭晓晶，许晓燕，孟 尧，武翠玲，赵兴秀，孟延发 ‘ (四川大学生命科学学院，成都610064) 摘要:通过平板初筛和摇瓶复筛，从105株菌中筛得一株甘油激酶的高产菌株，并研究了其所 产甘油激酶的动力学性质.研究结果表明:在酬王5系统中，甘油激酶有较好的酸碱稳定性，pH 稳定范围为5.5一10.5;最适pH和最适温度分别为pHS.0和50℃，该酶催化甘油的米氏常 数(Km)为3.5x10一’mol几，催化ATp的对m为4.46x10一4mol几.同时对一些金属离子和有 机化合物对酶活性的影响也进行了研究. 关键词:甘油激酶;德巴利酵母;动力学特性 中国分类号:Q55 文献标识码:A 甘油激酶(GlycerolKinase，EcZ.7.1.30)是一种广泛存在的酶，可以从不同来源的生物组织中提取得 到，目前主要是从大肠杆菌和嗜热脂肪芽胞杆菌中发酵生产’〔〕.甘油激酶是利用甘油代谢的限速酶[z]. 甘油激酶是酶法测定血液中甘油三醋的关键酶之一[3]，临床上使用酶法测定血液中甘油三醋的含量 具有简易、快速、特异、自动化分析及有利于标准化等优点，在我国正在逐步取代传统的化学检测方法[41. 推广应用酶法分析需要有合格的甘油激酶，但目前用于试剂盒的甘油激酶却主要依赖进口，因此研发甘油 激酶制剂具有重要的意义.我们主要讨论产甘油激酶菌种的筛选以及甘油激酶的基本动力学性质， 1材料与方法 1.1材料 Ba “llaceae 23株，Bacter故~ 18株，众ndida 16株，Ecoli25株，几巴耐。nzona :15株江沦乙口月阅阴夕“5 8株，均由本实验室保存. 过氧化物酶(POD)、甘油磷酸氧化酶系TOYOBO产品，三磷酸腺昔二钠盐、MEs系sigma产品，N， N一二乙基间甲苯胺系Aldrich产品，4一氨基安替比林系上海灵锦精细化工有限公司产品，其它主要试剂均 为国产或进口分析纯. Unico1JV一2102型紫外可见分光光度计，PHSZ型酸度剂上海第二分析仪器厂. 1.2 方法 1.2.1产酶菌株的筛选 使用平板法.在筛选平板上出现特征反应的为甘油激酶阳性菌.复筛培养基含 蛋白陈1%，牛肉膏0.3%，NaC1 0.5%，甘油0.2%，州7.0一7.2.于30℃培养24一48h，测发酵液和细胞 提取液的甘油激酶活力. 1.2.2初酶的制备 发酵液经4000r/min离心smin，用20rnm ol几pHS.OTrls~HCI缓冲液洗涤菌体2 次，再将菌体悬浮于上述缓冲液中用超声波破碎，破碎液12O00r/l刀in，4℃冷冻离心10min，所得上清液即 为GK粗酶液，比活为10.26U乃力L. 收稿日期:2005一1023 作者简介:谭晓晶(1981一)，女，2003级硕士研究生. ‘通讯作者.E-Inall演meng@163.net 1102 四川大学学报(自然科学版) 第43卷 1.2.3酶活性测定及活性单位定义 通过在545nm 测定Quinoneiminedye的吸光值大小，就可以测定 GK活力5〔，“〕酶单位定义:在50℃，每min催化生成1拜n101玩q所需的酶量为1个活力单位. 1.2.4温度对酶促反应速度的影响 2.omL不同温度下保温的底物溶液和50拌L酶液，精确反应 10min，50拌Lo.Zmol几TCA终止反应.测定545nm吸光值变化，观察酶活力随温度的变化. GK样品分别在不同温度下处理20min，然后在50℃测定酶活性，观察酶的热稳定性. 12.spH对酶促反应速度的影响 由不同PH缓冲液配制的底物溶液20mL，50拜L酶液，在50℃精确 反应10min，50拼LO.Zmol几TCA终止反应.测定