布鲁氏菌和幽门螺杆菌等6种病原菌16SrRNA和cagA等基因的克隆与鉴定.pdfVIP

2010，26 (8) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ChineseJourna1ofZoonoses 715 文章编号 ：1002—2694(2010)08—0715—05 布鲁氏菌和幽门螺杆菌等 6种病原菌 16SrRNA 和 cagA等基因的克隆与鉴定* 高正琴 ，岳秉飞 ，贺争鸣 摘 要 ：目的 克隆并鉴定布鲁 氏菌的 16Sr尺NA、支原体的 16SrRNA、泰泽 氏菌的16Sr尺NA、空肠弯 曲菌的flaA、肝 螺杆菌的flnB和幽 门螺杆菌的cagA基 因，为建立实时荧光定量 PCR检测方法作准备 。方法 设计、合成布鲁 氏菌的 16S rRNA、支原体的 16S NA、泰泽 氏菌的16Sr尺NA、空肠弯 曲菌 flaA、肝螺杆菌flaB和幽 门螺杆菌的cagA 基 因的特异性 引物；PCR扩增 、克隆 16Sr尺NA、flaA、flaB和cagA基 因；对重组质粒进行酶切鉴定 、PCR鉴定和测序分析。结果 布鲁 氏 菌的 16SrRNA、支原体 的 16S NA、泰泽氏菌的 16S NA、空肠弯 曲杆菌的 flaA、肝螺杆菌 的flaB和 幽门螺杆菌的ca— A基 因PCR扩增产物分别在 612bp、600bp、922bp、637bp、1545bp和 1168bp处出现特异性 目的条带，结果均与预期扩 增的 目的片段大小一致 。将 PCR产物分别与 pMD18一T载体连接并转化感受态细菌大肠埃希菌 JM109。对重组质粒 pT— BC16S NA、pT—MP16Sr尺NA、pT—CP16S NA、pT—CJflaA、pT—HHflaB和 pT—HPcagA 分别进行酶切鉴定及 PCR鉴 定，结果均可见特异性 目的条带。测序结果显示 ，布鲁氏菌的16SrRNA、支原体 的 16SrRNA、泰泽 氏菌的 16S NA、空肠 弯 曲菌 的flnA、肝螺杆菌的flaB和幽 门螺杆菌的cagA 基 因序列与GenBank中细菌相应序列同源性高达 100 ，说 明上述 6 种致病菌的16Sr尺NA、flaA、flaB和cagA基 因已成功克 隆。结论 成功克 隆了布鲁 氏菌 16S NA、支原体 的16S NA、 泰泽氏菌的 l65 ⅣA、空肠弯 曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基 因，为建立实时荧光定量 PCR检测方 法奠定 了基础 。 关键词 ：布鲁氏菌；支原体 ；泰泽氏菌；空肠弯 曲菌；肝螺杆菌；幽门螺杆菌，克隆；鉴定 中图分类号 ：R378 文献标识码 ：A Cloningandidentificationof16SrRNA andcagA genes from sixpathogenicbacteria includingBrucellaandHelicobacterpylori GAO Zheng—qin，YUE Bing—fei，HE Zheng—uring (NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts，Beijing100050，China) ABSTRACT：Tocloneandidentify16SrRNA genesofBrucellacanis，MycoplasmapulmonisandClostridium piliforme， flaAgeneofCampylobacterjejuni。flaBgeneofHelicobacterhepaticus，aswellascagAgeneofHelicobacterpylorforestab— lishingreal—timefluorescentquantitativepolymerasechainreactionmethod，pairsofspecificprimersforthesesixpathogenic bacteriaweredesigned and synthesized． Thensixspecificgenesfragmentswereamplifiedbypolymer