25-羟基维生素D3抗体的制备及ELISA检测方法的初步研究.pdfVIP

摘要 25．羟基维生素D3是人体内存储维生素D的主要形式之一，人体内代谢活动 不可缺少的营养物质，主要调节人体内的骨钙和血磷的平衡，随着近年来大量的 研究发现，25．羟基维生素D3也是人体内免疫系统中重要的免疫调节剂，调节人 体的免疫功能，同时作为人体细胞内维生素D受体的配体，参与调节人体细胞 内的生殖与分化，发挥其生物学效应。因此，人体内维生素D一旦缺乏，将直 接影响到人体内新陈代谢的平衡，危害人类的健康。据目前调查研究发现，全球 将近有十亿多人存在维生素D缺乏的现象，尤其是在儿童，老人和孕妇当中， 体内维生素D的缺乏，儿童易患佝偻病，老人易导致骨质疏松症等疾病；近年 来大量文献报道，体内维生素D的缺乏，与人类的癌症，自身免疫性疾病，感 染性疾病和心血管疾病的发生有着密切的联系，在临床诊断上将成为判断腺癌发 生的一项重要指标。因此，检测人体内维生素D含量对人们判别疾病的发生风 险和营养状况显得尤为的重要。目前在临床上对维生素D的定量检测已成为常 规检测项目和体检项目。目前只有国外Roche和IDS两家公司开发出了维生素 D3检测试剂盒用于临床检测，而国内还尚未有关25．羟基维生素D3检测试剂盒 ELISA检测方法并开发出拥有自主 开发的报道，因此建立起25．羟基维生素D3 知识产权的检测试剂盒，具有很强的社会意义和经济效益。 本文将25．羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团，合成具有半抗原 结构特征的25．羟基维生素D3．半琥珀酸酯，采用碳二亚胺法，将25．羟基维生素 工完全抗原25．羟基维生素D3．半琥珀酸酯．BSA和包被原25．羟基维生素D3．半琥 用25．羟基维生素D3．半琥珀酸酯．BSA免疫小鼠，获得高效价抗25．羟基维生素 D3多抗血清；并通过ProteinG纯化3号小鼠多抗血清，获得抗25．羟基维生素 D3多克隆抗体；采用间接ELISA方法检测多克隆抗体效价，对多克隆抗体进行 建立了良好的竞争抑制曲线图，并对其内似物(25．羟基维生素D2，维生素D2， 和维生素D3和1Q．25．OH维生素D3)测定其交叉反应率。结果表明：通过紫外 半琥珀酸酯一BSA人工完全免疫原，并鉴定出其偶联比为12+0．16：1，应用同样 的方法，制备出人工完全包被原25．羟基维生素D3．半琥珀酸酯．OVA；免疫4只 X 小鼠，其中3号小鼠获得高效价的多抗血清，效价达6．25 G纯 1酽，通过protein 化获得多克隆抗体；在直接竞争ELISA和间接竞争ELISA的比较中，宜采用间 接竞争ELISA法，抗原最佳包被浓度为铋g／mL，一抗，二抗最佳工作浓度分别 为1：4000，1：2000，且标准品浓度在37．5--600 ng／mL范围具有较好的竞争性线 性关系，检测的灵敏度为37．5 ng／mL。在间接竞争ELISA法中，与维生素D3， 维生素D2，1 反应率分别为70％。 关键词：25一羟基维生素D3：半抗原一[C一3]一载体蛋白偶联；人工完全抗原25． 羟基维生素D3 Abstract inhuman isa The isa nutrition body,which D3 25．hydroxyvitaminindispensable istobalancethelevelof formofvitaminDtobe itsfunction major stored，and researchdis