基因工程的基本操作程序1.pptVIP

课题二、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 * 提取目的基因 基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因的提取方法 人工合成基因 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA 鸟枪法（散弹射击法） 直接分离基因： 目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因 (一)、目的基因的获取 (1)从基因文库中获取目的基因 (2)利用PCR技术扩增目的基因 从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库？ 什么是基因组文库？ 什么是部分基因文库？ 概念：基因文库 （gene library） 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 　　　基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 　　　基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库. 基因组文库与部分基因文库的关系 DUCK179制作 　　怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢? 基因文库的构建方法 ①：直接分离法 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 受体细胞 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 (鸟枪法) 多用于原核生物 载入 逆转录法 目的基因的信使RNA 化学合成法 蛋白质的氨基酸序列 信使RNA的核苷酸序列 ＤＮＡ的核苷酸序列 目的基因 化学合成 逆转录 ②人工合成法（真核生物） 推测 推测 单链DNA 合成 双链DNA (即目的基因) 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 根据已知氨基酸合成DNA法 反转录法 鸟枪法 缺点 优点 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 利用PCR技术扩增目的基因 PCR——聚合酶链式反应 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。 PCR技术 原理： 前提： 原料 方式 PCR扩增仪 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 ：以_____方式扩增， 即____（n为扩增循环的次数） 指数 2n 模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 过程 变性、退火、延伸三步曲 变性：加热至90～95℃　　　　　　　双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 变性 退火 延伸 ①用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 ②用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 （二）基因表达载体的构建 —— 核心 ③将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 *