结核分枝杆菌Rv3717基因克隆、表达及功能鉴定.pdf

结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定 硕士生姓名： 陈 燕 指导教师： 辛毅教授 指导小组： 马郁芳教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘要 结核分枝杆菌是全球主要的病原体之一，随着多重耐药菌株的增加，其威胁 性也随之增大。结核分枝杆菌的细胞壁相对较厚、硬并且具有疏水性，能够有效 地保护细菌，因此抗菌药物的开发具有较高的难度。 息学的方法，发现一种未知功能的基因Rv3717。当乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌 后，Rv3717基因的表达上调。该基因被预测具有水解肽聚糖的功能，可能会造成 肽聚糖的水解，引起细胞的自溶。 肽聚糖是结核分枝杆菌细胞壁核心结构的重要组成部分，目前关于分枝杆菌 细胞壁自溶素(也称为肽聚糖水解酶)的了解并不多。已知枯草芽孢杆菌的cwlB 基因是一种已知的细胞壁自溶素，把此基因的序列与结核分枝杆菌的基因组序列 蛋白质可能同样具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明，Rv3915基因被成功克隆 表达并且经鉴定具有肽聚糖水解酶的活性。因此，Rv3717基因是否也有此活性是 本课题所要解决的问题。 对Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的确定，有利于揭示EMB抗结核的作用机 制，并为发现新的药物靶点进而开发新一代抗结核药物提供理论依据。 目的：通过对Rv3717目的基因的克隆表达，纯化目的蛋白，以对Rv3717基 因的功能进行鉴定。 方法：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，利用PCR技术进行目的基因的 扩增。使用克隆载体pMDl8．T与目的基因以‘‘A．r连接方式构建克隆质粒 pMDl8．Rv3717；被扩增的目的片段经测序正确后，载体和目的片段分别经双酶切 后进行连接，构建表达质粒。利用不同的载体和不同的宿主菌，通过调节诱导剂 的浓度和诱导温度等进行目的蛋白的优化表达。利用SDS．PAGE和Western blotting 检测目的基因的表达，利用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化并用酶谱法对目 的蛋白进行功能的检测。 结果：构建了克隆质粒pMDl8．Rv3717；扩增的目的基因经测序正确后，构建 pET29b．Rv3717在所使用的各种宿主菌中的蛋白表达量极低。表达质粒 体的形式存在，上清液中的可溶性目的蛋白比较少。目的蛋白的上清液经镍柱纯 化以后，得到含有少量杂蛋白的目的蛋白的纯化物。纯化的目的蛋白没有检测到 肽聚糖水解酶的活性。 结论：利用分子克隆技术克隆了结核分枝杆菌的基因Rv3717；使用表达质粒 以包涵体的形式存在。本论文论述了目的基因Rv3717与肽聚糖水解酶的关系，未 能检测出过表达的目的蛋白的肽聚糖水解酶的活性，但为进一步地探讨两者之间 的关系提供了方法学的借鉴和物质基础。 关键词：结核分枝杆菌乙胺丁醇肽聚糖水解酶Rv3717 2 characterizationof and Cloning，expression fromM．tuberculosis Rv3717 gene student：YanChen Graduate Advisor：ProfessorYiXin Co—advisor：ProfessorMa Yufang andMolecular Biology Major：Biochemistry