绿色木霉菌黄色素的发酵优化、提取分离及结构鉴定.pdf

摘要 本文以绿色木霉菌(Trichoderma viride) 为试验菌株，首先对其所产生的黄色 素进行发酵动力学特征的研究，然后对绿色木霉菌进行定向培养使其产生更多的 黄色素，在最优培养基组成及发酵条件下对黄色素发酵液进行提取、 离 物质 鉴定，得出绿色木霉菌黄色素5 个组 物质组成结构，为开发一种新型的微生物 代谢产生的天然色素提供研究依据。本文的主要研究成果如下： 1、绿色木霉菌(T. viride)黄色素发酵液不同稀释倍数的溶液在290nm 及380nm 处 有最大吸收峰，该黄色素最大吸收波长与已有较多报道的红曲黄色素的最大吸收 波长(370、388nm)相近。在T. viride 产黄色素的液态发酵过程中，通过测定菌体 干重、吸光值 （色价）、残糖浓度 pH 值，得到T. viride 液态发酵过程中菌体生 长、黄色素合成 底物消耗的动力学参数变化曲线。从发酵过程曲线可以得出绿 色木霉菌体生长 黄色素的合成属于 分生长偶 型。 2 、在培养基碳源、氮源组成，装液量及摇床转速、接种量、培养时间及培养温 度等单因素实验的基础上，采用Box-Behnken 设计及响应面 析法优化T. viride 产天然黄色素的培养基组成 发酵工艺条件。结果表明，在试验范围内，T. viride 产黄色素的优化培养条件为：马铃薯液态培养基（250 g L-1 马铃薯浸汁，2 -1 2 4 -1 g L Na HPO ），外加碳源选择21.7 g L 木糖，摇瓶装液量为50 mL/250 mL ，培 养温度35 ℃，接种量6%(v/v) ，摇床转速120 r min-1 ，培养时间152 h 。在优化培 养条件下发酵液黄色素的色价为52.8±0.8 U mL-1 。马铃薯培养基中添加尿素、硫 酸铵、蛋白胨、牛肉浸粉等氮源会抑制黄色素的生成。 3、利用薄层层析与红外及紫外光谱 用的方法快速、高效地获得了绿色木霉菌 黄色素物质成分的主要信息。通过对红外光谱谱图解析可知，三个色素成 谱图 曲线大致相同，每个物质又有不同的吸收谱带，黄色素物质中出现了羟基、氨基、 甲基、亚甲基、羧基及烯键、炔键、苷键、酯键的特征峰，各物质又不同程度地 含有芳香骨架，其在紫外扫描光谱中也得到了印证。由此可知色素物质含有的官 能团较多，结构比较复杂。在紫外光谱扫描中，三个明显的紫外吸收峰位置及强 度表明了该类色素物质为含有由少到多环的芳香烃类物质，其中成 b 、c 两者 都是稠环芳烃，可能是萘、蒽、菲等并各自有不同的取代基及官能团。 4 、通过对绿色木霉菌的黄色素及代谢物的溶 提取及 步萃取，及正相柱层析、 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱层析 高效液相色谱 （HPLC ）的 离方法，应用 电子喷雾质谱 （ESI-MS ），1H-1H COSY，13C-1H COSY，HMBC NOESY 在 内的一维 二维核磁共振技术进行鉴定，共得到 5 个纯品化合物。分别为:化合 物 E 1-2、2,4- 已二烯酸、Viridenepoxydiol、Sorbiquinol、Vertinolide 。其中 E 1-2 为从未报道的新化合物，且E 1-2、Sorbiquinol、Vertinolide 均为首次从 T. viride I 中 离出。 关键词：绿色木霉菌；黄色素；液态发酵条件；结构鉴定；核磁共振 II Abstract In order to develop a new and natural color material, this paper reports the experiment concerned with yellow pigment produced by Trichoderma viride.First, studies on fermentation process and dynamics of T. viride;Second, optimize culture medium compon