产高效细菌素乳酸菌筛选及鉴定.docVIP

产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定 摘 要：本研究旨在从自然生境中筛选产高效抑菌蛋白的乳酸菌，并进行抑菌活性分析和菌种鉴定。 通过牛津杯法抑菌试验对样本中乳酸菌进行初筛，然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋白酶处理，进一步复筛出产抑菌蛋白的乳酸菌。 通过形态学、生理生化、糖发酵（API）和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。结果表明：本研究成功地筛选出2株对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用的乳酸菌（抑菌圈直径均20 mm），证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌素，菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌。 本试验对高效细菌素—乳酸菌的研究为食品及饲料行业中乳酸菌素的开发和应用提供参考。 关键词： 乳酸菌；细菌素；筛选鉴定；抑菌活性 畜牧生产中抗生素滥用、病源微生物耐药性等 问题严重威胁着食品安全及人类健康，越来越多的 研究致力于寻找新型安全有效的绿色饲料添加剂作 为理想的抗生素替代品。细菌素是细菌在生长过程 中通过核糖体途径合成并分泌到环境中的具有抑菌 作用的蛋白或多肽物质，具有高效、无毒、耐高温、 无残留、无抗药性等优点 [1] 。目前国内外对细菌素的 研究主要集中在芽孢杆菌和乳酸菌上，乳酸菌是一 类可发酵碳水化合物、产生大量乳酸（50%）的革兰 氏阳性球菌或杆菌的统称 [2] 。饲料中添加乳酸菌制 剂可以促进动物胃肠道微生态平衡，改善动物健康 [3] 。 我国《饲料添加剂品种目录（2010）》中允许添加的29 种微生物菌种中有9种属于乳酸菌属。添加植物乳 杆菌的发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪含量明显上升，提 高饲料利用率 [4] 。Riboulet等 [5] 研究表明，乳杆菌素 Abp118对小鼠和猪的肠道沙门氏菌等致病菌有显著 的抑制作用并影响动物机体免疫力。因此对乳酸菌 细菌素抑菌能力的挖掘成为开发绿色饲料添加剂的 重点。本试验旨在筛选出对病原菌有高效、广谱抑 菌活性的产细菌素乳酸菌菌株，并对其进行菌株鉴 定，为天然安全的饲料添加剂的开发提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 生境材料（酸菜 、生牛奶 、青贮 料、土壤等）；指示菌为单增李斯特菌（L.monocytogenes cvcc1599）；金黄色葡萄球菌（S.aureus cvcc26003）；藤 黄八叠微球菌（S.lutea cmcc28001）；大肠杆菌（E.coil cvcc245）；沙门氏菌（S.typhimurium cvcc541）；培养基 （MRS、BPY、LB等），药品采用国产分析纯；细菌基因 组DNA提取试剂盒 （北京天根生化有限公司）； Analytic Products INCAPI50CH试剂盒（法国梅里埃）。 16SrDNA的PCR扩增引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′、1525R：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′。 1.2 产抑菌物质乳酸菌的初筛 乳酸菌的分离与 培养：将收集的样本悬浮于无菌生理盐水中按梯度 稀释，涂布于含溴甲酚紫指示剂（0.01%）的MRS琼 脂平板上，37℃培养箱培养48 h，挑选培养基变黄的 菌落划线纯化，选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孢的 菌株于MRS液体培养基中37℃培养12 h作为种子 液。种子液按2%接种于新的MRS液体培养基37℃静 置培养36 h作为发酵液。以8 000 r/min离心10 min， 取上清液备用。 指示菌的制备：选取的4株指示菌中大肠杆菌用 LB培养基，其余用BPY培养基，种子液按2%接种于 液体培养基37℃、150 r/min摇床过夜 （浓度约达 10 9 个/mL），稀释到10 7 CFU/mL备用。 菌株抑菌试验初筛：采用牛津杯法。取备用指示 菌（10 7 CFU/mL）150 μL涂布于BPY琼脂平板上，放置 3个牛津杯/板，常温干燥30 min。取菌株发酵上清200 μL 加入牛津杯内，以空白培养基为对照，3个重复/样， 置于37℃培养24 h，测定抑菌圈直径d（mm）。选取抑 菌效果较好的菌株进行复筛，用甘油-20℃保种备用。 1.3 产抑菌蛋白乳酸菌的复筛 同上制作初筛菌 株的发酵液和指示菌液。检测各菌株发酵上清液的 pH值，并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白 酶处理：①上清原液；②用NaOH调节上清至pH 5.5 ；③ 调节上清至pH7.2并用过氧化氢酶、蛋白酶（1mg/mL）处 理，37℃温育2 h后调回pH至5.5 [6] ；④对照：用乳酸、 乙酸调节pH为4.0的培养基。牛津杯法测抑菌活性。 选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌，牛津杯法 测定各菌株发酵上清抑菌活性，分析各菌株抑菌效 果并筛选出含有高效抑菌蛋白的乳酸菌作为目标菌株。 1.4