单克隆抗体-白介素2融合蛋白结构确证_百替生物.pdfVIP

- 2 - 2 单克隆抗体白介素 融合蛋白的结构确证 -- 22 项目完成单位：国家生物医学分析中心100850 项目完成人：董标 梁月琴 王杰 董方霆1 单克隆抗体-融合蛋白是指在基因水平将目的基因同抗体部分片段基因相连,并在真 核或原核细胞中表达出具有上述两部分结构域的重组蛋白，利用抗体对抗原的特异识别功 能将活性蛋白导向特定部位,使活性蛋白在特定部位发挥生物作用。目前对融合蛋白的研 [1–3] 究非常广泛,在临床治疗方面有极好的应用前景 。白细胞介素-2 （IL-2）又称T细胞生 长因子，是受抗原与T细胞受体结合刺激分泌的一种具有免疫调节作用的淋巴因子，临床 上已用于皮肤癌和肾细胞肿瘤的治疗。但使用高剂量IL-2治疗肿瘤时，经常会发生严重的 副作用，如血管通透性增加、肝脏毒性、窦性血管堵塞等。抗体-白介素2融合蛋白既保持 了白介素2的活性又具有抗体的专一性，大大提高药物对实体瘤的穿透性，减少对正常细 [2] 胞的非特异杀伤，获得显著疗效 。 单克隆抗体-白介素2融合蛋白是国内某单位研制的 [4] 生物技术药物，我们根据《中国生物制品规程》 的要求对抗体-白介素2融合蛋白的一些 理化性质进行测定，从而确证其一级结构。 一、 材料与方法 1.1 1.1 11..11 药品与试剂 单克隆抗体-白介素2融合蛋白1mg/ml（三批： 0202、0203、0204），单克隆抗体-白介 素2融合蛋白参考品（均由国内某单位提供）；胰蛋白酶（sigma公司）。其它试剂均为分析 纯。 1.2 主要仪器 491蛋白序列分析仪（美国AB公司）、HP1100型高效液相色谱仪（美国HP公司）、 TM P/ACE5000高效毛细管电泳仪（美国Beckman公司）、Bruker REFLEX III型基质辅助激 光解吸电离飞行时间质谱仪（德国Bruker公司）。 1.3 纯度的检测 用凝胶体积排阻法（SEC）测定：色谱柱 TSK3000SW(7.5 ×300mm)；流速 0.6mL/min ； 流动相 0.2mol/LpH7.0 磷酸缓冲液；检测波长280nm。 1.4 精确分子量的测定    选择芥子酸（SA）作为基质，用乙腈水（2 1）溶解，吸取1 L基质溶液与1 L样品  溶液混合均匀后，取1 L混合液滴加到样品靶上，待自然干燥后，将样品靶放到离子源 service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 中进行测定。氮激光器，波长337nm，线性正离子模式检测，加速电压20KV。 1.5 N-末端序列测定： 在样品溶液中加巯基乙醇还原后进行SDS分离，湿法电转印至PVDF膜上，考马 斯亮蓝（G-250）染色后脱色，得到两条带，分别剪下用491蛋白序列分析仪进行序列测定。 1.6 肽图分析[5]   取样品200ul，加100 l酶切缓冲液（1%碳酸氢铵）与胰蛋白酶按50 1（重量比）混 合，在37°C 恒温水浴保温12h后进行RP-HPLC 分析。色谱柱：intersilODS-3C ，