H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学系统建立.pdf

摘 要 猪流感是世界范围内养殖业常见呼吸道病和免疫抑制病，伴随呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、打 喷嚏和发热等症状。猪流感一旦暴发，将会给养殖也造成巨大损失，尤其当与其它呼吸道病继发 或混合感染，如猪繁殖与呼吸障碍综合征等，损失更是无法估量。猪流感除了其重要的兽医卫生 学意义外，更重要的还在于其显而易见的公共卫生学意义。 2004年，从广东省某发生呼吸道病的猪场采集的病料和棉签拭子中分离到一株病毒，病毒接 106 8／mL，TCID50为10_2／mL。 8-T载体，进行全基冈组序列测定。核苷酸序列测定结果显示：LM株SIV各基因 克隆到pMDI 片段均未发现核苷酸插入或缺失现象。HA切割位点处的氨基酸序列为IPSIQSR,LG，与高致病性 个潜在的N．糖基化位点，这可能是近期HINl亚型SIV的一个分子特征。核苷酸同源性结果： HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99％)，而其它基因均与古典猪谱系的流 感病毒分离株同源性较高(87％．98％)。从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果，可 以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒；而其它基因来源于古典猪谱系的流感病 毒。 序列测定的基础之上，将扩增的8个基因片段分别克隆到pHW2000双向转录表达载体中， 构建8个基因的重组阳性质粒。利用绿色荧光蛋白报告基因对聚合酶与核蛋白基因重组质粒活性 各个片段重组质粒共转染MDC龇93T细胞对病毒进行拯救，首次成功拯救出了全部基因均来自 10。‘7 序列测定结果显示，序列均与亲本毒株相应基因完全一致，说明重组病毒有良好的遗传稳定性， 该研究为下一步对HINI亚型猪流感病毒致病机理研究及细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。将 有高度细胞适应性的重组病毒re．．LM，该重组病毒接种MDCK细胞60h后，血凝价可以达到 l：1024，具有高产的特性。用该重组病毒制备的油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪，2周即可检测出 毒有良好的免疫原性。 关键词：猪流感病毒，反向遗传操作系统，细胞培养型流感疫苗，H1NI亚型 Abstract isa Influenzacommon and diseaseofswinein respiratory immunosuppressiVe swine-producing the clinical regionsthroughoutworld，withsigns，includingcoughing，nasaldischarge，sneezing， fever．Once depression，lethargy，labouredbreathing，and occurs．itcause economiclostto may great swine withother disease．suchasPRRS．Besidesitssevere industry，especially，co-infectingrespiratory influenzaalso serious healththreats． veterinaryimportance，swineposes public In virusstrainwasisolatedfromtissue andcottonswabscollectedin farmwith 2004，a samples pig tract in inSPF chicken‘sand problemsGuangdong．After respiratory propagationembryo