结核分枝杆菌Rv3807c基因克隆、表达及功能鉴定.pdf

结核分枝杆菌Rv3807c基因的克隆、表达及功能鉴定 硕士生姓名： 赵晓娇 指导教师： 辛毅教授 指导小组： 马郁芳教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘要 (Mycobacterium 基因组全长为4411532 bp，含有4044个基因，其中272个基因编码未知功能的 蛋白质，1051个基因编码具有保守序列的假定蛋白质(Conservedhypothetical protein)。 结核分枝杆菌的细胞壁是其赖以生存的重要屏障，可以作为研发抗结核药物 的靶标。分枝杆菌的细胞壁主要由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸三部分 成途径逐渐被阐明。其由三个连续反应组成：(1)磷酸核糖转移酶(Rv3806e)将 5．磷酸核糖焦磷酸(PⅪ)P)转移到聚十异戊二烯磷酸(DP)分子上形成5．磷酸核 催化DPR生成DPA。在此途径中，催化5-P．DPR脱磷酸的磷酸酶未被鉴定。而 膜蛋白，通过蛋白结构域预测其具有磷酸酶活性，该蛋白被推测催化5．P．DPR生 成了DPR。 本论文的目的是(1)克隆结核分枝杆菌Rv3807c基因。(2)在大肠杆菌中表 参与催化5-P．DPR生成DPR这一反应。 本论文使用的方法与获得的结果： 1．用PCR方法扩增目的基因Rv3807c 从结核分枝杆菌基因组数据库中获得TBRv3807c基因的核苷酸序列，并以此 设计PCR引物，在上下游引物中引入NdeI和BarnHI两个限制性酶切位点。用高 1 保真DNA聚合酶以H37Rv基因组为模板成功扩增出Rv3807c基因。 8T-Rv3807e 2．构建克隆载体pMDl 纯化PCR产物，并将其与pMDl8T载体进行连接，然后将连接产物转化入大 肠杆菌Novablue的感受态细胞中。用限制性内切酶鉴定重组质粒。 3．Rv3807e核苷酸序列的测定 存在任何碱基突变。 4．表达载体pETl6b-Rv3807e与pCold．Rv3807e的构建 用NdeI和BamHI双酶切pMDl BamHI双酶切两种酶切方法进行鉴定。 SDS．PAGE和Western blotting方法检测 和Western blotting方法检测，结果表明Rv3807e在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) 和E挖566(DE3)中成功表达。 的蛋白。 Western blotting方法进行检测。 8．R-v3807c蛋白质酶活性的测定 表达蛋白质的参与。 本论文利用分子克隆技术对结核分枝杆菌Rv3807e基因进行克隆，并使其在 大肠杆菌中进行了可溶性表达，通过超速离心提取出Rv3807e基因表达的膜蛋白， 并用薄板层析的方法对该蛋白质的功能进行检测。初步实验证明Rv3807e基因产 能的研究，对阐明DPA的合成途径提供了新的依据。 关键词：大肠杆菌Rv3807e磷酸酶 2 ‘ ‘。 “ Cioninl三．exl：． anandChnaracterizatlonoI RV3／C noisserpxe呈lninoic7083genevR from Tuberculosis Mycobacterial Master Zhao degreecandidate：Xiaojiao Yi Xin Supervisor：Professor