应用噬菌体表面展示技术筛选肝细胞p53启动子结合蛋白.pdfVIP

应用噬菌体表面展示技术筛选肝细胞p53 启动子结合 蛋白 1,2 1 3 2 1 吴顺华 ，郑玉建 ，钟彦伟 ，成军 ，张跃新 1 新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生学与环境卫生学教研室，乌鲁木齐 (830054) 2 北京地坛医院传染病研究所，北京 (100011) 3 解放军302 医院传染病研究所病毒性肝炎研究室，北京 (10039) E-mail：wushunhua@126.com 摘 要：目的 筛选p53 启动子结合蛋白，探讨P53 对肝细胞调节的分子生物学机制。 方 法 应用噬菌体表面展示技术，以 p53 作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞 cDNA 文库 进行5 轮“吸附-洗脱-扩增”过程，经噬斑的PCR 扩增后，构建克隆载体，最后对所筛选克隆 进行 DNA 测序和生物信息学分析。 结果 噬菌体经 5 轮富集后，成功构建了噬菌体 p53 展示文库，该文库包含与P53 结合的肝细胞蛋白有17 种。其中2 个克隆编码未知功能蛋白； 其余的克隆分别编码人α2HS 糖蛋白(AHSG)、人D4,锌指蛋白家族2(DPF2) 、凋亡反应锌指 基因(REQ)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子结合蛋白、氨基甲酰磷酸合成酶 1、磷酸化酶激 酶、酪氨酸氨基转移酶、酪蛋白激酶细胞周期素激酶、谷胱甘肽过氧化物酶、组蛋白结合蛋 白3、跨膜蛋白2 、血清粘蛋白2 、有核红细胞白血病病毒癌基因2 、毛细管扩张失调症突变 基因等蛋白，涉及到细胞发育和代谢、细胞外基质、细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡以 及原癌基因等方面。结论 p53 启动子DNA 在肝细胞具有结合多种类型和功能蛋白的作用。 关键词：噬菌体表面展示技术；p53 ；肝细胞 慢性砷中毒是全世界各国政府和研究工作者高度重视的重大公共卫生问题。主要是饮用 高砷水和燃高砷煤所诱发的慢性砷中毒，目前估计全世界受高砷威胁的人群超过 4700 万，慢 性砷中毒患者可达数十万人。仅在我国目前病区人口就达 300 万，而且慢性砷中毒病区有进 一步扩大的趋势。流行病学研究已证明慢性砷中毒可致皮肤损伤，手脚掌部皮肤角化以及其 他脏器损伤，特别可引起皮肤癌和肝癌、肺癌、膀胱癌等内脏肿瘤的高发，但砷作为确定的 人类致癌物，至今在动物身上未能获得致癌模型，使慢性砷中毒的分子作用机制一直未明确[1] 。 p53 肿瘤抗原是正常细胞所必需，在细胞恶性转化中起重要的作用。慢性砷中毒与 p53 的表达 异常紧密相关[2] 。噬菌体表面展示技术是近年来出现的一种新技术，其原理是将 cDNA 表达 文库基因通过与噬菌体外壳蛋白基因融合而将外源蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，将之与固 相化的目的分子结合，经过多轮的结合-淘洗过程，筛选出与目的分子（DNA 或蛋白）结合的 外源多肽或蛋白质，这种技术不仅可以应用到抗体基因的筛选、模拟表位的筛选、抗独特型 单链可变区抗体的筛选等，而且可以应用于蛋白结合蛋白的筛选和 DNA/RNA 结合蛋白的筛 选[3-5] 。在本研究中，我们应用噬菌体表面展示技术，从肝细胞T7 噬菌体 cDNA 文库中筛选 了与 p53 启动子结合的蛋白，试图寻找肝细胞内与 p53 具有相互作用的蛋白，探讨 p53 与肝 细胞蛋白相互作用的分子生物学机制。 1. 材料和方法 1.1 材料 T7select 人肝细胞 cDNA 文库，受体菌 BLT5615 （Novagen 公司），质粒 pGEM-Teasy （Promega 公司），Taq 酶、琼脂糖、dNTP、T4 连接酶、RNA 酶、玻璃奶 DNA 回收试剂盒 1本课题得到国家自然科学基金项目）教育部博士点基金（20040760002 ）的资助。 - 1 - （博大科技），大肠杆菌DH5α为本实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 p53 启动子的扩增